一种生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一种生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，该方法包括：以乳液为原料，利用大孔阳离子交换树脂柱进行离子交换处理，使乳液中的乳铁蛋白和乳过氧化物酶吸附在树脂柱上；其中，所述乳液温度≤55℃，并控制乳液在树脂柱中的停留时间为1～6分钟；采用不同浓度的氯化钠或氯化钾水溶液对树脂柱进行梯度洗脱，收集含有乳过氧化物酶的第一洗脱液和含有乳铁蛋白的第二洗脱液；将第一洗脱液、第二洗脱液分别经膜滤浓缩8～12倍，然后分别洗滤脱盐，得到乳过氧化物酶浓缩液和乳铁蛋白浓缩液。
【专利说明】
一种生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法
技术领域
[0001] 本发明是关于一种生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，具体是关于一种以牛 乳、乳清液等乳液为原料生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，属于乳制品加工技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳铁蛋白（Lactof errin，LF)又称"乳转铁蛋白"，是一种非血红素铁结合性糖蛋 白，属于转铁蛋白家族。各种哺乳动物乳中都具有乳铁蛋白，但其浓度因物种而异，人乳中 乳铁蛋白浓度约为1.0~3.2mg/ml，而牛乳中乳铁蛋白含量为0.02~0.35mg/ml。研究表明， 乳铁蛋白具有广谱抗菌和抗病毒感染作用，能够参与机体铁代谢，促进铁的吸收和利用，调 节体内铁的平衡，调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长，增强机体免疫抗病能力，抑制人 体肿瘤细胞，能与多种抗生素及抗真菌制剂协同作用更有效治疗疾病。近年来乳铁蛋白已 广泛应用于食品、医药、保健品和化妆品等领域。目前应用在食品行业中的商业化乳铁蛋白 制品多是从牛乳或分离酪蛋白后的乳清中提取得到的，主要方法包括:离子交换色谱法、疏 水相互作用色谱法、亲和色谱法、金属螯合色谱法、超滤和固定化单克隆抗体法等。其中，除 离子交换色谱法之外，其他色谱方法均有不同程度的缺陷，例如技术复杂、成本高等，不利 于工业化生产实施。而离子交换色谱法相对来说比较理想，其成本较低，耐酸碱，上样体积 大，较易精确控制条件，适合放大进行工业化生产，是当前生产乳铁蛋白的主流方法。
[0003] 乳过氧化物酶（lactoperoxidase，LP)是分泌在乳中的一种氧化还原酶，在哺乳动 物的乳腺、唾液腺、泪腺及其分泌物中都能找到，是人乳和牛乳中非常常见的成分之一。乳 过氧化物酶的生物学意义在于参与构成宿主对抗入侵微生物的天然防御系统，同时还具有 抗菌活性、降解各种致癌物质以及保护动物细胞被过氧化的作用。目前乳过氧化物酶的生 产也主要是从牛乳中提取得到，相关方法主要包括:牛乳脱脂-除酪蛋白-超滤离心-透 析及离子交换层析等。
[0004] CN1557494A公开了一种从牛初乳、牛奶或乳浆及其相关原料中同时制备乳铁蛋 白、乳过氧化物酶和免疫球蛋白的方法，主要过程为:离心方式脱脂，用50，000~70，000D的 超微滤膜滤除乳糖、矿物质、小分子蛋白质，用阳离子交换树脂吸附乳铁蛋白和乳过氧化物 酶后，分别用不同浓度缓冲盐溶液洗脱，冷冻干燥成粉，分别得到乳铁蛋白和乳过氧化物 酶，通过层析柱的液体用分子量为l〇〇,〇〇〇D的超微滤膜分离、过滤、浓缩后干燥成粉，得到 免疫球蛋白。
[0005] CN1557950A公开了一种从牛初乳、牛奶或乳浆中提取乳铁蛋白和乳过氧化物酶的 方法，其过程主要包括:采用离心方式去除脂肪，应用交错切面流体过滤分离装置滤除乳糖 及小分子物质，应用阳离子交换树脂吸附乳铁蛋白和乳过氧化物酶，用高渗离子渗透液洗 脱吸附的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，通过离子交换或超滤去除离子并浓缩，经冷冻干燥或 真空干燥制备成粉。其中记载的洗脱吸附的乳铁蛋白和乳过氧化物酶的高渗离子渗透液为 不同浓度盐缓冲液:低浓度的缓冲液(大约0.2~0.5mol NaCl)仅能洗脱乳过氧化物酶，高 浓度的缓冲液（大约2.5mo 1 NaCl)可以单独洗脱乳铁蛋白，而中等浓度的缓冲液（大约〉 0.7mol NaCl)能同时洗脱乳铁蛋白和乳过氧化物酶。此外，洗脱液需进行除盐程序，除盐的 方法可以是离子交换、电透析或超滤。
[0006] CN102348378A公开了一种生产乳过氧化物酶和乳转铁蛋白的方法，至少包括步 骤:a)使用没有在高于50°C的温度下处理过的原料，b)使该原料接受处理，以获得乳抑菌素 (LN)或乳碱性蛋白（MBP)的溶液，c)使该LN或MBP溶液接受在阳离子交换树脂上纯化的步 骤，该树脂用PH4~9的醋酸盐缓冲液平衡，并用含有不同溶质浓度的不同缓冲液洗脱，和d) 收集含有纯度超过95%，不含有聚合物并且基本上没有LPS、内毒素和血管生成素的乳转铁 蛋白的级分。其中步骤c)包括至少四个洗脱步骤，一个收集杂质的步骤，一个收集乳过氧化 物酶的步骤，一个收集LPS、内毒素、蛋白酶和血管生成素的步骤和一个收集乳转铁蛋白的 步骤。其中还记载了应用含有不同NaCl浓度的不同缓冲液来洗脱LN中所含的不同分子。
[0007] 现有的离子交换色谱法生产乳过氧化物酶和乳转铁蛋白的方法，多是需要预先除 去乳液中的乳糖、矿物质和/或小分子蛋白质，用平衡液平衡柱子，步骤相对比较繁琐，且普 遍而言，速度慢，不利用工业化生产，或是回收率并不十分理想。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供一种工艺简单、经济、高效且产品纯度较高的生产乳铁 蛋白和乳过氧化物酶的方法。
[0009] 本发明的另一目的在于提供按照上述方法制备得到的乳铁蛋白和乳过氧化物酶 产品。
[0010] -方面，本发明提供了一种工艺简单、经济、高效且产品纯度较高的生产乳铁蛋白 和乳过氧化物酶的方法。
[0011]根据本发明所提供的生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，其包括：
[0012] 以乳液为原料，利用磺酸基官能团大孔阳离子交换树脂柱进行离子交换处理，使 乳液中的乳铁蛋白和乳过氧化物酶吸附在树脂柱上;其中，所述乳液温度<55°C，并控制乳 液在树脂柱中的停留时间为1~6分钟（10-60个柱体积每小时）；
[0013] 采用第一洗脱溶液对树脂柱进行洗脱，收集洗脱液，得到含有乳过氧化物酶的第 一洗脱液;其中，所述第一洗脱溶液为浓度1 %~2.5%的氯化钠或氯化钾水溶液；
[0014] 采用第二洗脱溶液对树脂柱进行洗脱，收集洗脱液，得到含有乳铁蛋白的第二洗 脱液;其中，所述第二洗脱溶液为浓度4.5%~12%的氯化钠或氯化钾水溶液；
[0015] 将第一洗脱液、第二洗脱液分别经膜滤浓缩8~12倍，然后分别洗滤脱盐，得到乳 过氧化物酶浓缩液和乳铁蛋白浓缩液。
[0016] 根据本发明的具体实施方案，本发明的生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法中， 还可进一步包括:分别对乳铁蛋白浓缩液和乳过氧化物酶浓缩液进行微滤除菌或巴氏杀 菌，制备无菌的乳铁蛋白浓缩液和乳过氧化物酶浓缩液。
[0017]根据本发明的具体实施方案，本发明的生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法中， 还可进一步包括:分别对乳铁蛋白浓缩液和乳过氧化物酶浓缩液(前述未经杀菌或经杀菌 的浓缩液)进行干燥，制备乳铁蛋白粉和乳过氧化物酶粉;其中，所述干燥为冷冻干燥或低 温喷雾干燥。
[0018]根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述原料乳液包括所有乳铁蛋白 来源的乳液，例如人乳、牛乳、羊乳、马乳、驼乳等，可以是初乳、全脂乳、脱脂乳或乳清液(包 含浓缩乳清液）。优选地，这些乳液未经过55 °C以上温度处理。
[0019] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述乳液原料在利用大孔阳离子 交换树脂柱进行离子交换处理之前，无需除去乳糖、矿物质和/或小分子蛋白质。
[0020] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，在利用大孔阳离子交换树脂柱进 行离子交换处理前无需采用缓冲液平衡柱子，即，该方法不必包括在利用大孔阳离子交换 树脂柱进行离子交换处理前采用缓冲液平衡柱子的过程。
[0021] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述原料乳液的温度优选为42°C ~55°C，此处理温度下乳液可以是全脂乳液也可以是脱脂乳液，且可有效防止乳铁蛋白受 热变性，同时可以显著的缩短乳液在树脂柱中的停留时间，提高生产效率;另外，如果处理 脱脂乳，则热脱脂后不需要再进行热交换处理，可以节约能耗。
[0022] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述原料乳液粒径分布小于10微 米(D90粒径），优选8微米以下，例如2~8微米，可保证离子交换的有效进行，同时过滤器的 可选孔径范围较大，运行成本也会降低。
[0023] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述大孔阳离子交换树脂为一类 阳离子交换树脂。优选强阳离子交换树脂的功能基团有磺酸基类，例如磺酸基、磺酸乙基、 磺酸丙基等。更优选的，本发明所用的强阳离子大孔交换树脂的粒径在200微米~350微米 之间。
[0024]根据本发明的具体实施方案，本发明所述乳液在离子交换树脂柱中的停留时间为 1~6分钟，优选为1~2分钟，既可保证乳铁蛋白和乳过氧化物酶的吸附率，又可降低乳铁蛋 白和乳过氧化物酶的受热时间，缩短加工提取时间，提高生产效率。
[0025] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，洗脱过程采用的是梯度洗脱，第一 步梯度洗脱溶液为包含低浓度的氯化钠或者氯化钾水溶液或缓冲溶液，第二步梯度洗脱溶 液包含高浓度氯化钠或氯化钾水溶液或缓冲溶液。根据本发明第一洗脱溶液的氯化钠或氯 化钾的浓度为1 %~2.5%，第二步梯度洗脱溶液的氯化钠或氯化钾的浓度为4.5%~12% ; 或者为包含该浓度氯化钠或氯化钾的磷酸氢钠缓冲溶液，由此可以很好的洗脱分离乳过氧 化物酶和乳铁蛋白，且溶液盐含量相对较低，污水处理难度较低。
[0026] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，采用膜滤工艺将第一和第二洗脱 收集液分别进行浓缩及脱盐。第一步膜滤浓缩过程所用的膜孔径为30kDa~50kDa，浓缩时 既能保证浓缩浓度又能保持很好的通量，提高工作效率。将料液浓缩10倍，然后洗滤脱盐， 到电导率小于2mS/cm。由于乳铁蛋白和乳过氧化物酶属于大分子蛋白，在低离子浓度溶液 中，随着蛋白浓度的增加，料液会变粘进而易于发生聚集沉淀，进而堵塞膜孔，因此浓缩的 倍数不易过过高，适宜即可。脱盐使得料液的的离子强度显著降低，当料液的粘度过高，离 子的脱除效率会显著降低，与低粘度时料液脱盐效率相比，脱除相同比例的盐分，则需要消 耗大量的水资源，因此离子脱除率适中即可，不需要将离子强调降低到极致;另一方面在低 离子强度溶液中会导致蛋白沉淀，使得生产无法进行，所以脱盐后料液的离子强度不易过 低。因此本发明选择料液浓缩10倍，脱盐后料液固型物含量大约在10%~25%，电导率小于 2mS/cm，这样即可以保证产品的质量，又可以保证设备的高效正常运转，同时还节能降耗。
[0027] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，可进一步将浓缩溶液进行冷冻干 燥，得到纯度大于90%的乳铁蛋白冻干粉和纯度大于90%的乳过氧化物酶冻干粉，且两种 蛋白粉中有效成分占蛋白的95%以上，利于工业化应用和储运。
[0028] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，可进一步将浓缩溶液进行低温喷 雾干燥，得到纯度大于90%的乳铁蛋白喷干粉和纯度大于90%的乳过氧化物酶喷干粉，且 两种蛋白粉中有效成分分别占总蛋白含量的95%以上，利于工业化应用和储运。
[0029] 根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，还可进一步将所浓缩溶液采用膜 滤除菌或者72~75°C，15秒巴氏杀菌，制备成10%~25%的无菌液体包，便于液体产品的无 囷后添加。
[0030] 另一方面，本发明还提供了按照本发明的所述方法制备得到的乳铁蛋白和乳过氧 化物酶产品。回收率可达80%以上，按照本发明生产的乳铁蛋白产品呈淡粉色，颗粒均匀， 纯度达到90%以上，有效成分占蛋白的95%以上，具有良好的抑菌性和抗氧化性。按照本发 明生产的乳过氧化物酶产品呈前褐色或浅紫色，纯度达到90%以上，有效成分占蛋白的 95 %以上，具有良好的酶活性。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明的方法的流程示意图。
[0032]图2为实施例1中乳铁蛋白纯度检测谱图。
[0033]图3为实施例1中乳过氧化物酶纯度检测谱图。
【具体实施方式】
[0034]为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说 明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。
[0035]各实施例中用到的检测方法：
[0036] 1.抑菌率检测方法
[0037] (1)菌液制备:将大肠杆菌接种于10mL蛋白胨水中，于37°C培养活化16h(水浴摇床 及培养箱均可），按照接种一定量将第一代活化菌液转移至新的蛋白胨水中，活化培养调整 其浓度达到1 〇6~1 〇7CFU/ml，再稀释10倍备用。
[0038] (2)乳铁蛋白溶液制备:溶解乳铁蛋白粉，配制一定浓度的乳铁蛋白溶液，以0.2μπι 针头式滤膜过滤乳铁蛋白溶液，同时将无菌液体包样品稀释到相同浓度。
[0039] (3)平板计数方法:在8.6mL蛋白胨水中添加0.4mL配置好浓度的乳铁蛋白溶液，再 添加 lmL 105~106的大肠杆菌菌液，培养24h取样进行平板计数，同时做不添加乳铁蛋白的 空白对照样。 rnnw 埘讲杳。，空白对照菌落总数-实验组菌落菌数湖(V
[0040]抑 _ 率 ％ =-々口-x 100% 土 [二丨对照组Eih客忍数
[0041 ] 2 ·抗氧化能力(FRAP)性方法
[0042] FRAP试剂:40mL 0.3M醋酸缓冲液(pH 3.6)，4mL 20mM FeC13溶液，4mL 10mM TPTZ (2，4，6-tri s (2-吡啶-s-三嗪））混合。所有试剂在测试前预热至37 °C，在96孔酶标板中进行 测试，混合20yL纯水、1 OyL乳铁样品和150yL FRAP试剂，立即在37 °C下保温，对于抗坏血酸， 测定593nm下5min时的吸光值，对于乳铁样品，每5min测定一次，直到24h。样品的抗氧化分 值(FRAP值)相对于抗坏血酸的FRAP值得到。该值越高，表明抗氧化性越强。
[0043] 3.酶活性方法检测
[0044] 3.1溶液配制
[0045] 100微升30 %的双氧水以纯水定容至10mL，配成0.3 %双氧水溶液。
[0046] 0.5mg/mL ABTS溶液，称取0.0125g ABTS于25mL容量瓶中，以ρΗ5·5的柠檬酸钠-柠 檬酸缓冲液定容。
[0047]样品前处理:将纯化得到的LP溶液稀释一定的倍数。
[0048] 3.2操作步骤
[0049] 取2mL配置好的ABTS溶液放置于比色皿中，在37°C烘箱或水浴中保温lOmin，之后 快速加入〇. lmL的乳过氧化物酶溶液(稀释后的）和2微升双氧水溶液，混合均匀后迅速放入 分光光度计中，在412nm波长下测定吸光度，同时计时，lmin和2min时分别读数。
[0050] 3.3计算
[0051 ] 公式如下：
[0052] 活性
[0053] 4.纯度检测
[0054] 4.1实验材料:乳铁蛋白；Tris;氢氧化钠（分析纯）；氯化钠(分析纯）；盐酸（分析 纯）；乙醇(分析纯）；阳离子交换树脂。
[0055] 4.2实验仪器:层析仪;乳成分分析仪(FT120)
[0056] 4.3实验方法：
[0057] 原奶取回后在4°C下进行储藏，在当天或次日进行检测，检测前进行脱脂处理，在 10000转/分钟的条件下进行两次离心，脱出脂肪后，进行上样。
[0058]原奶乳铁含量检测流程
[0059]
[0060] A溶液：0.05M Tris-HCl溶液pH=7;
[0061 ] B溶液:盐浓度为 1M Tris-HCl-NaCl溶液pH=7。
[0062] 实施例1
[0063] 参照图1所示工艺流程，按照以下步骤制备乳铁蛋白及乳过氧化物酶：
[0064] 取脂肪含量小于0.2%、粒径小于8微米的乳液(脱脂牛乳），温度在4°C~10°C之 间，利用离子交换树脂对该乳液进行离子交换处理，以便使乳铁蛋白和乳过氧化物酶吸附 到离子交换树脂上，牛奶在树脂柱中的保留时间为2min，然后用水将乳液顶出。
[0065] 第一步洗脱采用约4个柱体积的1%的氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，得到乳 过氧化物酶盐溶液；
[0066] 第二步洗脱采用约4个柱体积的4.5 %的氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，得到 乳铁蛋白盐溶液；
[0067]将洗脱得到的乳铁蛋白盐溶液和乳过氧化物酶盐溶液分别利用孔径为30kDa的膜 将料液浓缩10倍，然后洗滤脱盐处理，以便获得纯化的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，二者脱盐 后料液的固型物含量在10%，电导率1.5mS/cm。
[0068] 冷冻干燥:将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进行冷冻干燥得到冻干蛋白粉；
[0069] 或选择液体包者，将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进行膜滤除菌或者72~75 °C、15秒巴氏杀菌，制备成无菌乳铁蛋白或乳过氧化物酶液体包。
[0070] 图2为本实施例中乳铁蛋白纯度检测谱图。图3为本实施例中乳过氧化物酶纯度检 测谱图。
[0071] 实施例2
[0072] 参照图1所示工艺流程，按照以下步骤制备乳铁蛋白及乳过氧化物酶：
[0073] 取脂肪含量小于0.5%、粒径小于8微米的乳液，温度在15°C~20°C之间，利用离子 交换树脂对该乳液进行离子交换处理，以便使乳铁蛋白和乳过氧化物酶吸附到离子交换树 脂上，牛奶在树脂柱中的保留时间为2min，然后用水将乳液顶出。
[0074] 第一步洗脱采用约4个柱体积的1.2%的氯化钾溶液进行洗脱，得到乳过氧化物酶 盐溶液；
[0075] 第二步洗脱采用约4个柱体积的5%的氯化钾溶液进行洗脱，得到乳铁蛋白盐溶 液；
[0076]将洗脱得到的乳铁蛋白盐溶液和乳过氧化物酶盐溶液分别利用孔径为50kDa的膜 将料液浓缩10倍，然后洗滤脱盐处理，以便获得纯化的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，二者脱盐 后料液的固型物含量在12%，电导率小于1.8mS/cm。
[0077] 冷冻干燥或低温喷雾干燥或者膜滤除菌:将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进 行冷冻干燥得到冻干蛋白粉;或者将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进行低温喷雾干燥 得到喷干的蛋白粉;或者将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进行膜滤除菌或者72~75 °C，15秒巴氏杀菌，制备成无菌乳铁蛋白或乳过氧化物酶液体包。
[0078] 实施例3
[0079] 参照图1所示工艺流程，按照以下步骤制备乳铁蛋白及乳过氧化物酶：
[0080] 取全脂、粒径小于8微米的乳液，温度在52°C~55°C之间，利用离子交换树脂对该 乳液进行离子交换处理，以便使乳铁蛋白和乳过氧化物酶吸附到离子交换树脂上，牛奶在 树脂柱中的保留时间为lmin，然后用水将乳液顶出。
[0081] 第一步洗脱采用约4个柱体积的2.5 %的氯化钠溶液进行洗脱，得到乳过氧化物酶 盐溶液；
[0082] 第二步洗脱采用约4个柱体积的10%的氯化钠溶液进行洗脱，得到乳铁蛋白盐溶 液；
[0083]将洗脱得到的乳铁蛋白盐溶液和乳过氧化物酶盐溶液分别利用孔径为50kDa的膜 将料液浓缩10倍，然后洗滤脱盐处理，以便获得纯化的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，二者脱盐 后料液的固型物含量在15%，电导率小于1.2mS/cm。
[0084] 冷冻干燥或低温喷雾干燥或者膜滤除菌:将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进 行冷冻干燥得到冻干蛋白粉;或者将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进行低温喷雾干燥 得到喷干的蛋白粉;或者将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进行膜滤除菌或者72~75 °C，15秒巴氏杀菌，制备成无菌乳铁蛋白或乳过氧化物酶液体包。
[0085] 实施例4
[0086] 参照图1所示工艺流程，按照以下步骤制备乳铁蛋白及乳过氧化物酶：
[0087] 取脂肪含量为0.8%、粒径小于8微米的乳液，温度在52°C~55°C之间，利用离子交 换树脂对该乳液进行离子交换处理，以便使乳铁蛋白和乳过氧化物酶吸附到离子交换树脂 上，牛奶在树脂柱中的保留时间为lmin，然后用水将乳液顶出。
[0088] 第一步洗脱采用约4个柱体积的2.5 %的氯化钠溶液进行洗脱，得到乳过氧化物酶 盐溶液；
[0089] 第二步洗脱采用约4个柱体积的12%的氯化钠溶液进行洗脱，得到乳铁蛋白盐溶 液；
[0090] 将洗脱得到的乳铁蛋白盐溶液和乳过氧化物酶盐溶液分别利用孔径为50kDa的膜 将料液浓缩10倍，然后洗滤脱盐处理，以便获得纯化的乳铁蛋白和乳过氧化物酶，二者脱盐 后料液的固型物含量在18 %，电导率小于1.0lmS/cm。
[0091 ]冷冻干燥或低温喷雾干燥或者膜滤除菌:将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进 行冷冻干燥得到冻干蛋白粉;或者将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进行低温喷雾干燥 得到喷干的蛋白粉;或者将上述乳铁蛋白和乳过氧化物酶分别进行膜滤除菌或者72~75 °C，15秒巴氏杀菌，制备成无菌乳铁蛋白或乳过氧化物酶液体包。
[0092] 实施例5
[0093]以市售的乳铁蛋白为对照，采用平板计数方法测算抑菌率，同时对实施例1~4的 乳铁蛋白样品进行纯度、抑菌活性和抗氧化性检测，结果如下表：
[0094]表1乳铁蛋白特性分析结果
[0095]
[0096] 注：以上结果为3次测定的平均值，抗氧化值越高，代表抗氧化性越强。 [0097]表2乳过氧化物酶特性分析结果
[0098]
[0099]注：以上结果为3次测定的平均值。
【主权项】
1. 一种生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，该方法包括： 以乳液为原料，利用磺酸基官能团大孔阳离子交换树脂柱进行离子交换处理，使乳液 中的乳铁蛋白和乳过氧化物酶吸附在树脂柱上;其中，所述乳液温度<55°C，并控制乳液在 树脂柱中的停留时间为1~6分钟； 采用第一洗脱溶液对树脂柱进行洗脱，收集洗脱液，得到含有乳过氧化物酶的第一洗 脱液;其中，所述第一洗脱溶液为浓度1 %~2.5%的氯化钠或氯化钾水溶液； 采用第二洗脱溶液对树脂柱进行洗脱，收集洗脱液，得到含有乳铁蛋白的第二洗脱液； 其中，所述第一洗脱溶液为浓度4.5%~12%的氯化钠或氯化钾水溶液； 将第一洗脱液、第二洗脱液分别经膜滤浓缩8~12倍，然后分别洗滤脱盐，得到乳过氧 化物酶浓缩液和乳铁蛋白浓缩液。2. 根据权利要求1所述的方法，该方法还包括： 分别对乳铁蛋白浓缩液和乳过氧化物酶浓缩液进行微滤除菌或巴氏杀菌，制备无菌的 乳铁蛋白浓缩液和乳过氧化物酶浓缩液。3. 根据权利要求1或2所述的方法，该方法还包括： 分别对乳铁蛋白浓缩液和乳过氧化物酶浓缩液进行干燥，制备乳铁蛋白粉和乳过氧化 物酶粉;其中，所述干燥为冷冻干燥或低温喷雾干燥。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述原料乳液包括含有乳铁蛋白和乳过氧化物酶 的人乳、牛乳、羊乳、马乳、驼乳中的一种或多种;可以是初乳、全脂乳、脱脂乳或乳清液;优 选地，这些乳液未经过55 °C以上温度处理;更优选地，这些乳液在利用大孔阳离子交换树脂 柱进行离子交换处理之前，无需除去乳糖、矿物质和/或小分子蛋白质。5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述原料乳液的温度为42°C~55°C，乳液粒径分 布小于10微米，优选8微米以下。6. 根据权利要求1所述的方法，该方法不包括在利用大孔阳离子交换树脂柱进行离子 交换处理前采用缓冲液平衡柱子的过程。7. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述乳液在树脂柱中的停留时间为1~2min。8. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述膜滤浓缩过程所用的膜孔径为30kDa~ 50kDa〇9. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述洗滤脱盐过程中脱盐至电导率小于2mS/cm。10. 按照权利要求1~9任一项所述方法制备得到的乳铁蛋白产品或乳过氧化物酶产 品；优选地，乳铁蛋白产品中蛋白含量90 %以上，有效成分占蛋白的95 %以上;乳过氧化物 酶产品中蛋白含量90%以上，有效成分占蛋白的95%以上。
【文档编号】C07K1/18GK106008704SQ201610637105
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月5日
【发明人】王彩云, 罗述博, 闫序东, 云战友, 刘卉芳, 杨吉武
【申请人】内蒙古伊利实业集团股份有限公司