专利名称：：牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白及其编码基因与应用。技术背景乳铁蛋白(LactoferrinLF)亦称乳转铁蛋白，主要指存在于哺乳动物乳清中的球蛋白，由SorensenM和SorensenSPL(1938年)首次从牛乳中分离出来。目前，已明确了乳铁蛋白中多肽链的一级结构，乳铁蛋白由690个左右的氨基酸组成，人乳铁蛋白分子量为82.4KDa,有692个氨基酸残基;牛乳铁蛋白分子量为83.lKDa，由689个氨基酸组成。它们的结构相似。体外用胃蛋白酶分别水解人、牛、猪的LF，可获得相应的抗菌肽(Lfcin)。Lfcin都有一个由二硫键形成的环状物，该环状物由18个氨基酸组成。人Lfcin由LF残基20到37构成，牛Lfcin由残基19到36构成。乳铁蛋白具有促进铁吸收、抗氧化及免疫调节活性等诸多生物学功能，但最引人关注的是抗菌作用。LF的抗菌活性可能有两种机制抑菌和灭菌作用。LF的灭菌区与细菌细胞膜上的LF受体类似物结合，导致细胞壁损伤。LF的灭菌区现已被确定和纯化，并把含有该灭菌区的肽片段命名为乳铁多肽素(Lfcin)，它具有广谱抗菌抗病毒感染作用，在医学上的应用非常广泛。研究表明乳铁多肽素的抗菌活性是乳铁蛋白未降解前的400倍(Bellamy,1992)，是起抗菌作用的主要肽段。乳铁蛋白及其衍生物的研究开发只在少数几个发达国家中进行,如美国的Baylor医学院，荷兰的Pharming公司，日本的MoriagaMilkIndustryCoLtd等。目前,在工业规模上从脱脂乳及乳清中分离牛乳铁蛋白，纯度可达95%以上，但是费用昂贵。Baylor医学院和Agennix公司开发了乳铁蛋白的重组生产技术并利用重组乳铁蛋白开发新的治疗药物和抗微生物化合物。美国Ge叩harm公司和荷兰Pharming公司主要是通过转基因动物来生产乳铁蛋白。重组乳铁蛋白的临床前评价已于1996年完成，于1997年进行临床试验。日本SnowBrandMilkProdCoLtd、MorinagaMilkIndustryCoLtd等制备了在大肠杆菌中表达乳铁蛋白基因的重组质粒载体。1994年MitraA等把人乳铁蛋白基因的cDNA置于35S启动子之下，转入烟草细胞，检测到48kD不完整的蛋白，外源蛋白含量占全部细胞蛋白的30.6-2.5%，体外抑菌试验证明，转基因烟草表达的乳铁蛋白不仅对所供试的四种病原菌有抑菌活性，而且其活性比全长乳铁蛋白强。SalmonV(1998)构建了两个含有不同信号肽序列的人乳铁蛋白基因表达载体，发现该基因均能在烟草中表达，重组蛋白N末端与来自人乳的乳铁蛋白相同。AnzaiH(1999)把人乳铁蛋白基因转入水稻和番茄，在水稻谷蛋白启动子控制下，成功地获得了在水稻种子中特异表达的乳铁蛋白。Samyn-PetitB(2001)把人乳铁蛋白与小麦麦谷蛋白启动子连在一起转入玉米中，在稳定转化的第四代植株种子中检测到所表达的乳铁蛋白。目前关于乳铁蛋白的遗传转化研究已有很多，但乳铁蛋白抗菌肽基因的转化研究很少，仅发现该基因在烟草、玉米、大豆等植物中能够正常表达，起到抗菌作用，但表达量均不理想，无法达到生产应用的要求。
发明内容本发明的目的是提供牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白及其编码基因与应用。本发明的牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白，是如下a)或b)的蛋白a)两个或两个以上的序列表中序列2自氨基末端第4-28位所示的多肽通过含有蛋白酶酶切位点的氨基酸序列连接形成的蛋白质，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列与序列表中序列2自氨基末端第4-28位所示的氨基酸序列没有同一性；b)将a)限定的蛋白质的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且具有抗菌活性的由a)衍生的蛋白质。其中，所述蛋白酶为FactorXa酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。为了使a)中的融合蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>上述b)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的融合蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1或者序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。其中，所述的牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白可是两个序列表中序列2自氨基末端第4-28位所示的多肽融合形成的蛋白质；也可是四个序列表中序列2自氨基末端第4-28位所示的多肽融合形成的蛋白质。所述的牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白具体可是如下1)或2)的蛋白1)其氨基酸序列为序列表中序列2的蛋白；2)其氨基酸序列为序列表中序列4的蛋白。其中，序列表中序列2由62个氨基酸残基组成，序列表中序列2自氨基末端第31-34位为蛋白酶FactorXa识别位点，自氨基末端第4-28位和第38-62位为乳铁蛋白抗菌肽。序列表中序列4由130个氨基酸残基组成，序列表中序列4自氨基末端第31-34位、第66-69位和第99-102位为蛋白酶FactorXa识别位点，自氨基末端第4-28位、第38-62位、第72-96位和第106-130位为乳铁蛋白抗菌肽。编码牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围。所述基因具体可是如下l)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1;2)其核苷酸序列是序列表中序列3;3)在严格条件下与l)或2)限定的DNA片段杂交且编码具有抗菌活性的蛋白的DNA分子；4)与l)或2)的基因具有90%以上的同源性，且编码具有抗菌活性的蛋白的DNA分子。所述步骤4)中的基因，与l)或2)的基因最好有95%以上的同源性。序列表中的序列1由214个碱基组成，编码序列表中序列2所示的融合蛋白。序列表中的序列3由415个碱基组成，编码序列表中序列4所示的融合蛋白。上述严格条件可为在6XSSC，0.5y。SDS的溶液中，在68。C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。扩增上述基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有上述基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述融合基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pC娜IA1300、pBI121、pBinl9、pC腦IA2301、pC纖IA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明所述的融合基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明所述基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。本发明的另一个目的是提供一种培育含有所述融合蛋白的转基因植物的方法。本发明所提供培育含有所述融合蛋白的转基因植物的方法，是将所述的重组表达载体导入植物细胞中，得到含所述融合蛋白的转基因植物。其中，所述的转基因植物可用于生产牛乳铁蛋白抗菌肽，如从所述的转基因植物中提取所述的融合蛋白，利用能识别所述融合蛋白中的FactorXa酶切位点的蛋白酶降解所述融合蛋白，获得牛乳铁蛋白抗菌肽。本发明将牛乳铁蛋白抗菌肽单一基因成倍累加串连成重复序列，将上述重复序列构建到植物双元表达载体pCAMBIA3301中，并转化烟草中获得含有两个拷贝的乳铁蛋白抗菌肽基因和四个拷贝的乳铁蛋白抗菌肽基因的转基因烟草，并且提取了所述转基因烟草的粗蛋白，进行抗菌实验，实验结果表明，所提取的.粗蛋白具备抗菌能力，与转单拷贝的乳铁蛋白抗菌肽基因的烟草的单位质量的粗蛋白相比抑菌能力有显著的提高，说明转多拷贝的乳铁蛋白抗菌肽基因的烟草的单位质量的总蛋白中抗菌肽的含量比转单拷贝的乳铁蛋白抗菌肽基因的烟草的高。利用本发明的牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白及其编码基因培育的植物，可作为生物反应器生产抗菌肽。图1为串连抗菌肽基因构建模式2为串连抗菌肽基因植物表达载体构建模式图图3为牛乳铁蛋白抗菌肽基因两个拷贝的串连a为PCR扩增lfcl和lfc2片段，1、2为PCR扩增lfcl的产物，3、4为PCR扩增lfc2的产物；b图为PCR鉴定tlfc片段；c图为BglII、BstEII双酶切鉴定TEasy/tlfc质粒。图4为牛乳铁蛋白抗菌肽基因四个拷贝的串连a为PCR扩增tlfcl和tlfc2片段，1、2为PCR扩增tlfcl的产物，3、4为PCR扩增tlfc2的产物；b为PCR鉴定flfc片段；c为BglII、BstEII双酶切鉴定TEasy/flfc质粒。图5为植物表达载体构建检测图图6为PCR鉴定转基因烟草图7为转基因烟草蛋白抑菌能力分析图8为转基因烟草蛋白与大肠杆菌(^sc力en'c^'aDH5a共培养后菌液平板培养具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成和测序工作均由上海生工完成。实施例l、乳铁蛋白抗菌肽基因两个拷贝串连一、PCR扩增乳铁蛋白抗菌肽基因由上海申友合成两条长单链DNA，第一链5'ACGGGAGCTCAGATCTTCAACMTGGAGTGGTTCAAGTGCCGCCGCTGGCAGTGGCGCATGAAGAAGCTGGGCGCCCCCA3，第二链5，AGCTGGTCACCTCTAGATCAGAAGGCGCGGCGCACGCAGGTGATGCTGGGGGCGCCCAGCTTCTTCATGCGCCACTGCCA3，两条链退火补平，成为双链的牛乳铁蛋白抗菌肽编码序列。退火补平条件为第一链50uMlul，第二链50uMlul，TaqDNA聚合酶0.5ul，dNTP混合物2^1，10XPCRbuffer5|il，MgCl2(25uM)3ul，补充水至终体积50ul。将上述反应物置于94。C热水浴中，热水温度逐渐下降至65。C，然后置于冰上5min。将此产物克隆到pGEM-TEasy载体上，构建重组质粒，命名为pGEM-TEasy/lfc。pGEM-TEasy/lfc作为模板，以lfclSP和lfclASP为引物对PCR扩增lfcl，以lfc2SP和lfc2ASP为引物对PCR扩增lfc2。引物序列如下lfclSP5'CGGGAGCTCAGATCTTCAACAATGGAGTGGTT3'划线部分为BglII识别位点；lfclASP5'TCTGGATCCGAAGGCGCGGCGCAC3'划线部分为BaraHI识别位点；lfc2SP5'GGGATCCATAGATGGAAGAATGGAGTGGTTCA3'划线部分为BamHI识别位点；lfc2ASP5'TTCGATTAGCTGGTCACCTCTAGATCAGAAGGC3'划线部分为BstEII识别位点；预先将PCR仪加热至94°C(热启动可保证得到特异的PCR扩增产物)；PCR反应体系如下10XPCRbuffer5fil、10mMdNTPmixlfil、正义引物(10M)1|11、反义引物(10M)l|il、模板(lOOpg/pl)2^1、Taq酶(5UAi1)0.5^1、补充水到总体积为50pl。将冰上放置的以上混合物放入已预热好的PCR仪，按照以下程序进行扩增先94。C5min，然后94。C45s，64°C45s，72°C45s;进行30个循环，最后72。C7min，4"C保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图3a，分别回收lfcl和lfc2的PCR产物，将lfcl和lfc2分别克隆到pGEM-TEasy载体上，构建重组质粒，分别命名为pGEM-TEasy/lfcl和pGEM-TEasy/lfc2。将pGEM-TEasy/lfcl、pGEM-TEasy/lfc2质粒转化入大肠杆菌DH5a感受态8细胞中，在含有氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基(含有IPTG+X-gal)上筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒DNA。二、两个乳铁蛋白抗菌肽基因拷贝的串联片段tlfc的制备用BamHI和PstI分别双酶切pGEM-TEasy/lfcl和pGEM-TEasy/lfc2(PstI是载体上的一个酶切位点)，pGEM-TEasy/lfcl酶切后得到3100bp的大片段和20bp左右的小片段；pGEM-TEasy/lfc2酶切后得到130bp左右的小片段和3000bp的大片段。回收pGEM-TEasy/lfcl的3100bp的大片段和pGEM-TEasy/lfc2的130bp左右的小片段并连接，构建重组载体pGEM-TEasy/tlfc，然后将pGEM-TEasy/tlfc转化到大肠杆菌DH5a。从转化的平板上挑取单菌落，以lfclSP、lfc2ASP为引物进行菌液PCR，鉴定阳性克隆，结果如图3b。用BglII和BstEII双酶切PCR鉴定为阳性克隆的质粒，经琼脂糖凝胶电泳，出现230bp左右的条带，进一步验证lfcl和lfc2串联在一起，结果如图3c。挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序，测序结果表明，pGEM-TEasy/tlfc中所含的两个乳铁蛋白抗菌肽基因拷贝的串联片段由214bp个核苷酸残基组成，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码序列表中序列2所示的蛋白。其中，序列表中序列2自氨基末端第31-34位为蛋白酶FactorXa识别位点，自氨基末端第4-28位和第38-62位为乳铁蛋白抗菌肽。将该片段命名为tlfc。实施例2、四个乳铁蛋白抗菌肽基因拷贝的串联片段flfc的制备一、PCR扩增tlfcpGEM-TEasy/tlfc质粒为模板，以tlfclSP和tlfclASP为引物对扩增tlfcl，以tlfc2SP和tlfc2ASP为引物对扩增tlfc2。引物序列如下tlfclSP5'CGGGAGCTCAGATCTTCAACAATGGAGTGGTT3';tlfclASP5'TCACCTCTAGACCAGAAGGCGCGGCG3';tlfc2SP5'AGTCTAGAATTGAAGGAAGGGAGTGGTTCAAGT3';tlfc2ASP5'GGTGGTCACCAGATCAGAAGGCGC3'。PCR扩增反应体系和反应程序与实施例1相同。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图4a所示，分别回收tlfcl和tlfc2的PCR产物，将tlfcl和tlfc2分别克隆到pGEM-TEasy载体上，构建重组质粒，分别命名为pGEM-TEasy/tlfcl和pGEM-TEasy/tlfc2。将pGEM-TEasy/tlfcl和pGEM-TEasy/tlfc2质粒分别转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基(含有IPTG+X-gal)上筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒DNA。二、四个乳铁蛋白抗菌肽基因拷贝串连片段flfc的制备用XbaI和PstI分别双酶切pGEM-TEasy/tlfcl和pGEM-TEasy/tlfc2(PstI是载体上的一个酶切位点)，tlfcl酶切后得到3200bp的大片段和20bp左右的小片段；tlfc2酶切后得到220bp左右的小片段和3000bp的大片段。回收tlfcl的3200bp的大片段和tlfc2的220bp左右的小片段并连接，构建重组载体pGEM-TEasy/flfc，然后将pGEM-TEasy/fIfc转化到大肠杆菌DH5a。从转化的平板上挑取单菌落，以tlfclSP和tlfc2ASP为引物进行菌液PCR，鉴定阳性克隆，结果如图4b。用BglII和BstEII双酶切PCR鉴定为阳性克隆的质粒，经琼脂糖凝胶电泳，出现430bp左右的条带，进一步验证tlfcl和tlfc2串联在一起，结果如图4c。挑选酶切鉴定正确的克隆进行测序，测序结果表明，所得的片段由415个核苷酸残基组成，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，编码序列表中序列4所示的蛋白。其中，序列表中序列4自氨基末端第31-34位、第66-69位和第99-102位为蛋白酶FactorXa识别位点，自氨基末端第4-28位、第38-62位、第72-96位和第106-130位为乳铁蛋白抗菌肽。将该片段命名为flfc。实施例3、转pCAMBIA3301/tlfc和pCAMBIA3301/flfc烟草的获得1)植物表达载体pCAMBIA3301/tlfc和pCAMBIA3301/flfc的构建用BglII和BstEII分别双酶切pGEM-TEasy/tlfc和pGEM-TEasy/flfc质粒和pCAMBIA3301质粒，并回收所需片段，大小分别为214bp、415bp和9.3Kb，将回收tlfc的214bp片段及flfc的415bp片段分别与回收的pCAMBIA3301的9.3Kb片段连接，T4DNA连接酶连接反应4hr(16t:水浴)，连接产物转化大肠杆菌DH5a，在含有卡那霉素的培养基上筛选出阳性克隆，挑选阳性克隆，以lfclSP和lfc2ASP、tlfclSP和tlfc2ASP为引物进行菌液PCR检测，选择菌液PCR鉴定正确的质粒，用多组合内切酶进行酶切鉴定。PCR检测和酶切鉴定结果如图5所示，图5中，a为菌液PCR鉴定pCAMBIA3301/tlfc，PCR扩增出214bp的片段为PCR鉴定正确的pCAMBIA3301/tlfc，o+为pCAMBIA3301/tlfc质粒作正对照；b为两组酶酶切进一步鉴定PCR鉴定正确的pCAMBIA3301/tlfc，1、2为NheI和XhoI酶切产物，产物为568bp、3443bp和5468bp的三两条片段；3、4为NheI和KpnI酶切产物，产物为1566bp、3487bp和4426bp的三两条片段。d为菌液PCR鉴定pCAMBIA3301/flfc,PCR扩增出415bp的片段为PCR鉴定正确的pCAMBIA3301/flfc;e为酶切鉴定pCAMBIA3301/flfc，1为NheI和KpnI酶切产物，产物为1566bp、3487bp和4627bp的三两条片段；2为SalI和NheI酶切产物，产物为1338bp、3732bp和4610bp的三两条片段;3为BglII、BstEII酶切产物，产物为415bp和9265bp的两条片段；c为农杆菌菌液PCR鉴定pCAMBIA3301/tlfc;f为农杆菌菌液PCR鉴定pCAMBIA3301/flfc。用BglII和BstEII分别双酶切pGEM-TEasy/lfc和pCAMBIA3301质粒，并回收pGEM-TEasy/lfc酶切产物中的小片段和pCAMBIA3301酶切产物中9.3Kb的大片段，将上述的87bp的小片段和9.3Kb的大片段连接构建pCAMBIA3301/lfc重组表达载体。2)转pCAMBIA3301/tlfc、pCAMBIA3301/flfc和pC細BIA3301/Ifc烟草的获得取lpgpCAMBIA3301/tlfc、pCAMBIA3301/flfc和pCAMBIA3301/lfc的质粒DNA，分别转化农杆菌LBA4404感受态细胞，涂布于YEB培养基(含100ng/ml卡那霉素和125pg/ml链霉素)上，28°C培养两天。挑选单克隆提取质粒DNA进行PCR和酶切鉴定，得到鉴定正确的阳性克隆。将鉴定正确的阳性克隆的农杆菌接种于YEB液体培养液(含有100ng/ml卡那霉素和125pg/ml链霉素)中，28。C振荡培养至0De。。为0.6-0.8;4000rpm，室温离心IO分钟，用MS盐溶液(PH7.0)重新悬浮菌体，使用时将MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。取烟草(N.tabacum)无菌苗叶片，切去叶片边缘和主要叶脉，将叶片切成0.4x0.6cm2大小，将0.4x0.6cm2大小的叶片在制备好的农杆菌菌液中浸泡10分钟，用无菌滤纸吸干上述叶片表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基中暗培养3天。然后转到添加除草剂PPT(6rag/L)和头孢霉素(50(^g/ml)的筛选培养基中培养，每日光照1216小时，28。C培养。每两周继代一次，每次将变黄的叶片和愈伤丢掉，大的愈伤切割成小块，经三到四代继代培养的愈伤组织陆续分化成幼苗，将幼苗转移入生根培养基中诱导生根，28。C培养，每日3000Lx光强光照16小时，待根系发育完全后，移栽到温室中。3)转pCAMBIA3301/tlfc、pC纖IA3301/flfc和pCAMBIA3301/lfc烟草的PCR扩增检测ii分别取转pCAMBIA3301/tlfc、pCAMBIA3301/flfc和pCAMBIA3301/lfc的烟草幼嫩叶片，磨碎后加入400"1SDS提取缓冲液，混匀，在65'C水浴中保温30min;然后每管中加入等体积Tris饱和酚和氯仿/异戊醇混合液(24:l)混匀，放置5min后离心；将上清液转移到新的离心管中，加两倍体积无水乙醇，混匀，使核酸沉淀成絮状，12000rpm离心10min，弃上清，用lml70%的乙醇洗涤沉淀，沉淀晾干后，溶于适量无菌水中。取12u1样品DNA按照实施例1所述的PCR扩增反应程序和所需试剂组分，利用lfclSP和Ifc2ASP引物检测转pCAMBIA3301/tlfc和pCAMBIA3301/lfc，利用tlfclSP和tlfc2ASP引物检测转pCAMBIA3301/flfc的烟草。取PCR产物进行电泳检测。以质粒pCAMBIA3301/tlfc、PCAMBIA3301/flfc和pCAMBIA3301/lfc为阳性对照，转pCAMBIA3301烟草基因组DNA为阴性对照。阴性对照没有特异性扩增产物，转pCAMBIA3301/tlfc烟草的阳性植株中扩增出230bp的特异产物，转pCAMBIA3301/flfc烟草的阳性植株中扩增出430bp的特异产物，结果如图6，图6a为PCR鉴定转两个拷贝乳铁蛋白抗菌肽基因串连(tlfc)的阳性烟草，CK一为转pCAMBIA3301的烟草，17为转两个拷贝乳铁蛋白抗菌肽基因串连(tlfc)的阳性烟草，CK+为pCAMBIA3301/tlfc。图6b为PCR鉴定转四个拷贝乳铁蛋白抗菌肽基因串连(flfc)的阳性烟草，CK-为转pCAMBIA3301的烟草，17为转四个拷贝乳铁蛋白抗菌肽基因串连(tlfc)的阳性烟草的不同株系，CK+为pCAMBIA3301/flfc。在20株转pCAMBIA3301/flfc烟草中鉴定出18阳性植株，在29株转pCAMBIA3301/tlfc烟草中鉴定出26阳性植株。转pCAMBIA3301烟草按照上述方法获得并鉴定，在10株转pCAMBIA3301/lfclpCAMBIA3301/lfc烟草中鉴定出8阳性植株。实施例4、抑菌能力检测剪取2.5g新鲜转pCAMBIA3301/tlfc、pC扁IA3301/flfc和pCAMBIA3301/lfc烟草叶片分别置于高压灭菌的研钵里，液氮中研磨成粉末，分别转入含有5ml冰冷的蛋白提取缓冲液(0.5M蔗糖；0.01MTris-HC1，PH7.5;0.1%抗坏血酸)的50ml离心管中，混匀，置于冰上30min提取蛋白，然后12000r即离心30min,吸出上清，得到烟草粗蛋白溶液。然后用考马斯亮蓝染色法对上述烟草除蛋白进行定量，调节各个样品间浓度一致，用于抑菌实验。首先用蛋白酶FactorXa将串连在一起表达的乳铁蛋白抗菌肽分开，起到增加蛋白含量和避免蛋白高级结构对功能影响的作用。蛋白酶FactorXa反应体系为lml蛋白粗提液中加入10"g蛋白酶FactorXa，23。C条件下反应6hr。抑菌实验的供试靶标病原菌为大肠杆菌(^sc力erich'aco")DH5a菌株。菌落计数采用平板菌落计数法。实验重复3次。抑菌实验的步骤如下取蛋白粗提液lml，0D,为0.4的菌液lml和0.5mlLB液体培养基共同振荡4hr，之后将菌液采取系列指数稀释，即取100ix1菌液加入900u1LB液体培养基稀释成l(T浓度的菌液，之后从l(T浓度的菌液中取100u1菌液加入900u1LB液体培养基稀释成10—2浓度的菌液，以此类推稀释成10—'10—7浓度的菌液，取10—410—7浓度的菌液各50nl，分别涂在LB固体培养基平板上，37。C条件下倒扣平板培养过夜(1216hr)，之后记录平板上的菌斑数。每个处理三个重复。10—4浓度的菌液涂板后菌斑太多无法计数，l(T6、l(T浓度的菌液菌斑数很少，非转基因烟草的负对照与样品无法区分，因此菌液涂板计数分析转基因烟草蛋白的抑菌能力以菌液浓度10—5为适宜浓度。实验结果如图7和8所示，表明所有转基因烟草表达的蛋白与非转基因烟草的负对照相比都有一定的抑制大肠杆菌DH5a生长和增殖的能力，菌斑数都明显减少；四个串连序列表达的蛋白经过蛋白酶FactorXa的切割，菌斑数明显减少，抑菌能力较单基因表达的蛋白有23倍的提高。图7中，l为未转基因烟草，2-4为转pCAMBIA3301/tlfc烟草，5-7为转pCAMBIA3301/flfc烟草，8-10为转pCAMBIA3301/lfc烟草。图8中，A为非转基因烟草蛋白与大肠杆菌(￡^c/eric/iacoh')DH5a共培养后稀释10—5的菌液涂板结果；B为转单基因(pCAMBIA3301/lfc)烟草蛋白与大肠杆菌(^5c力eric力^co7i)DH5a共培养后稀释10—5的菌液涂板结果；C为转串连基因(pCAMBIA3301/flfc)烟草蛋白与大肠杆菌(^sc力erich'aco7i)DH5a共培养后稀释10—5的菌液涂板结果。上述实验结果表明，转二个或四个拷贝的乳铁蛋白抗菌肽基因的烟草的总蛋白中乳铁蛋白抗菌肽的含量明显的提高，单位质量的二个或四个拷贝的乳铁蛋白抗菌肽基因的烟草的总蛋白抑菌能力比单位质量的转单拷贝的乳铁蛋白抗菌肽基因的烟草的总蛋白的抑菌能力高，且差异显著，说明串连增加基因拷贝数对提高外源蛋白在植物中的表达起到一定的作用。序列表<110>中国农业大学<120〉牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白及其编码基因与应用<130〉CGGNARW81494<160>4〈210>1〈211>214〈212〉DNA<213>人工序列〈220><223〉〈400〉1agatcttcaacaatggagtggttcaagtgccgccgctggcagtggcgcatgaagaagctg60ggcgcccccagcatcacctgcgtgcgccgcgccttcggatccatagatggaagaatggag120tggttcaagtgccgccgctggcagtggcgcatgaagaagctgggcgcccccagcatcacc180tgcgtgcgccgcgccttctgatctagaggtgacc214〈210〉2〈211〉62<212>PRT〈213〉人工序列<220><223〉<400>2MetGluTrpPheLysCysArgArgTrpGinTrpArgMetLysLysLeu151015GlyAlaProSerlieThrCysValArgArgAlaPheGlySerlieAsp202530GlyArgMetGluTrpPheLysCysArgArgTrpGinTrpArgMetLys354045LysLeuGlyAlaProSerlieThrCysValArgArgAlaPhe505560<210>3〈211〉415<212〉丽〈213>人工序列〈220〉〈223〉〈400〉3agatcttcaacaatggagtggttcaagtgccgccgccggcagtggcgcatga卿agctg60ggcgcccccagcatcacctgcgtgcgccgcgccttcggatccatagatggaagaatggag120tggttcaagtgccgccgctggcagtggcgcatgaagaagctgggcgcccccagcatcacc180tgcgtgcgccgcgccttctggtctagaattgaaggaagggagtggttcaagtgccgccgc240tggcagtggcgcatgaagaagctgggcgcccccagcatcacctgcgtgcgccgcgccttc300ggatccatagatgg犯gaatggagtggttcaagtgccgccgctggcagtggcgcatgaag360犯gctgggcgcccccagcatcacctgcgtgcgccgcgccttctgatctggtgacc41515〈210〉4〈211〉130〈212〉PRT〈213〉人工序列<220>〈223〉<400〉4MetGluTrpPheLysCysArgArgArgGinTrpArgMetLysLysLeu151015GlyAlaProSerlieThrCysValArgArgAlaPheGlySerlieAsp202530GlyArgMetGluTrpPheLysCysArgArgTrpGinTrpArgMetLys354045LysLeuGlyAlaProSerlieThrCysValArgArgAlaPheTrpSer505560ArglieGluGlyArgGluTrpPheLysCysArgArgTrpGinTrpArg65707580MetLysLysLeuGlyAlaProSerlieThrCysValArgArgAlaPhe859095GlySerlieAspGlyArgMetGluTrpPheLysCysArgArgTrpGin100105110TrpArgMetLysLysLeuGlyAlaProSerlieThrCysValArgArg115120125AlaPhe130权利要求1、一种融合蛋白质，是如下a)或b)的蛋白a)两个或两个以上的序列表中序列2自氨基末端第4-28位所示的多肽通过含有蛋白酶酶切位点的氨基酸序列连接形成的蛋白质，所述蛋白酶酶切位点的氨基酸序列与序列表中序列2自氨基末端第4-28位所示的氨基酸序列没有同一性；b)将a)限定的蛋白质的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且具有抗菌活性的由a)衍生的蛋白质。2、根据权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于所述蛋白酶为FactorXa酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。3、根据权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是如下1)或2)的蛋白1)其氨基酸序列为序列表中序列2的蛋白；2)其氨基酸序列为序列表中序列4的蛋白；3)在l)或2)限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸由乳铁蛋白抗菌肽融合形成的由1)或2)衍生的蛋白质。4、编码权利要求1至3中任一所述融合蛋白的基因。5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述基因是如下l)或2)或3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列l;2)其核苷酸序列是序列表中序列3;3)在严格条件下与l)或2)限定的DNA片段杂交且编码具有抗菌活性的蛋白的DNA分子；4)与l)或2)的基因具有90%以上的同源性，且编码具有抗菌活性的蛋白的DNA分子。6、含有权利要求4或5所述基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。7、扩增权利要求4或5所述基因的全长及其任意片段的引物对。8、一种培育含有权利要求1至3中任一所述融合蛋白的转基因植物的方法，是将权利要求6所述的重组表达载体导入植物细胞中，得到含所述融合蛋白的转基因植物。9、权利要求8所述方法培育的转基因植物在生产牛乳铁蛋白抗菌肽中的应用。10、一种生产牛乳铁蛋白抗菌肽的方法，是从权利要求8所述的转基因植物中提取权利要求1至3中任一所述的融合蛋白，利用能识别所述融合蛋白中的蛋白酶酶切位点的蛋白酶降解所述融合蛋白，获得牛乳铁蛋白抗菌肽。全文摘要本发明公开了一种牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白及其编码基因与应用。该牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白是如下a)或b)的蛋白a)两个或两个以上的序列表中序列2自氨基末端第4-28位所示的多肽融合形成的蛋白质；b)将a)限定的蛋白质的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且具有抗菌活性的由a)衍生的蛋白质。本发明还公开了该牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白的编码基因。利用本发明的牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白及其编码基因培育的植物，可作为生物反应器生产抗菌肽。文档编号C07K19/00GK101628941SQ20081011687公开日2010年1月20日申请日期2008年7月18日优先权日2008年7月18日发明者王国英,王建华,王春英申请人:中国农业大学