一种用酿酒酵母生产乳铁蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用酿酒酵母生产乳铁蛋白的方法。该方法包括如下步骤：(1)构建重组菌：将表达盒导入宿主菌；所述表达盒依次由启动子Ppgk、α-信号肽基因和乳铁蛋白Lfcin B的编码基因连接而成；(2)诱导培养所述重组菌，得到乳铁蛋白菌液；(3)将所述菌液离心，收集上清；从上清中沉淀乳铁蛋白，即得到所述的乳铁蛋白。实验结果表明：本发明利用酿酒酵母进行发酵得到的抗菌肽乳铁蛋白对大肠杆菌DH5α有明显的抑菌作用。
【专利说明】一种用酿酒酵母生产乳铁蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种用酿酒酵母生产乳铁蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国畜牧业发展迅速，其产值约占农业总产值的三成，已成为农业经济中 的重要支柱产业。然而，由于饲养环境差、生产技术相对落后、动物疫病形势严峻，对整个行 业产生了严重的影响。通过改善饲养环境、改进生产技术能解决上述前两个问题；而在解决 动物疫病这一问题时，则通常采用在动物饲料中长期、大量地添加抗生素来达到防治疫病 的目的。抗生素的大量使用，在短期内对控制疫病确实起到了"解燃眉之急"的作用，但长 期滥用抗生素，不仅会破坏动物消化系统的微生态平衡，而且会使一些病原菌产生耐药性。 同时，由于抗生素在动物体内的残留，对人类的健康也造成了威胁。基于以上负面效应，欧 盟于2006年全面禁止抗生素在动物饲料中使用。我国自加入WTO以来，抗生素的使用严重 影响了我国畜牧业产品在国际市场中的竞争力；随着人民生活水平的普遍提高，畜产品的 来源、生产和加工过程中的质量安全问题也日益成为民众关注的焦点。因此，开发新型抗生 素替代品对我国畜牧业的可持续发展起着十分重要的作用。
[0003] 抗菌肽（antibacterial peptides)是一类小分子多肽，具有抵御外界病原微生物 侵害、消除体内突变细胞的作用。其结构大致分为5类：（1)单链无半胱氨酸残基的α-螺 旋，或由无规则卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽；（2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨 酸残基的抗菌肽；（3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β -折 叠结构的抗菌肽；（5)由其它已知功能的、较大的多肽衍生而来且具有抗菌活性的肽。抗菌 肽由生物特定基因编码，具有广谱抗菌活性，尤其对耐药菌株有明显的杀灭作用，但不破坏 动物细胞，无免疫原性，具有高效、安全、无残留等优点，能调节免疫作用，不干扰肠道有益 菌等特性，将其应用于畜牧业，是一种最具开发前景的抗生素替代品。
[0004] 乳铁蛋白（Lactoferrin，LF)由1939年Sorensen等人在分离乳清蛋白时发现， 并由Groves于1960年从牛乳中分离得到。牛乳铁蛋白肽（Bovine Lactoferricin,简写 为Lfcin B)是经胃蛋白酶从牛乳铁蛋白（bLF)N-端（17?41)水解的25个氨基酸残基， 分子量约为3. lkd。Lfcin是bLF的抗菌活性中心，对bLF抗菌活性起重要作用（Kanget al，1996)。Lfcin B是Lfcin活性中心抑菌效果最明显的部分，其抑菌效果是牛乳铁蛋白的 400倍，在维持胃肠道正常菌群中发挥重要作用。Lfcin B在水溶液中呈亲水脂的两个反向 β折叠结构，具有耐热、在消化道不易被降解、无抗原性的特征，能调节免疫作用，具有广谱 抗菌作用，不干扰肠道有益菌等特性。其对许多G+和G-均有抗菌作用，如大肠杆菌、肠炎 沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等，但不作用于双歧杆菌等对人体有 益细菌、同时还能刺激细胞的生长、参与免疫调节。因此，在农业、畜牧、医疗等领域有广阔 的应用前景。
[0005] 天然抗菌肽来源广泛，但存在成本高、分离纯化难等问题。而基因工程技术因具有 成本低，操作简便，易于分离纯化等特点而成为近年来的研究热点。高效表达抗菌肽的分子 改良、新型发酵生产技术的建立，饲料专用抗菌肽新产品的开发，已成为该领域研发者们的 重要目标。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种生产乳铁蛋白的方法。
[0007] 本发明提供的生产乳铁蛋白的方法包括如下步骤：
[0008] (1)构建重组菌：将表达盒导入宿主菌；
[0009] 所述表达盒依次由启动子Ppgk、α -信号肽基因和乳铁蛋白Lfcin B的编码基因 连接而成；
[0010] (2)诱导培养所述重组菌，得到乳铁蛋白菌液；
[0011] (3)将所述菌液离心，收集上清；从上清中沉淀乳铁蛋白，即得到所述的乳铁蛋 白。
[0012] 上述方法中，所述从上清中沉淀乳铁蛋白的方法为依次用丙酮和三氯醋酸进行沉 淀和浓缩。
[0013] 上述方法中，所述宿主菌为酿酒酵母INVScl。
[0014] 上述方法中，所述乳铁蛋白Lfcin B的氨基酸序列如SEQ ID No. 5中第1-35位氨 基酸所示；所述乳铁蛋白Lfcin B的编码基因序列如SEQ ID No. 4第1-105位核苷酸分子 所示。
[0015] 上述方法中，所述α -信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第1-95位氨基酸所 示；所述α -信号肽的编码基因序列如SEQ ID No. 2中第1-285位核苷酸分子所示。
[0016] 上述方法中，所述启动子Ppgk的核苷酸序列如SEQ ID No. 1中第1-793位核苷酸 分子所不。
[0017] 上述方法中，将所述表达盒导入酵母菌中的方法为：将所述表达盒插入PYES2载 体的多克隆位点，得到重组载体；再将重组载体导入所述宿主酵母菌中。
[0018] 本发明的另一个目的是提供一种重组菌。
[0019] 本发明提供的重组菌是将表达盒导入宿主菌获得的。
[0020] 上述重组菌中，所述表达盒依次由启动子Ppgk、α -信号肽基因和乳铁蛋白Lfcin B的编码基因连接而成。
[0021] 上述重组菌中，所述宿主菌为酿酒酵母INVScl。
[0022] 上述重组菌中，所述乳铁蛋白Lfcin B的氨基酸序列如SEQ ID No. 5中第1-35位 氨基酸所示；所述乳铁蛋白Lfcin B的编码基因序列如SEQ ID No. 4第1-105位核苷酸分 子所示。
[0023] 上述重组菌中，所述α -信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第1-95位氨基酸 所示；所述α -信号肽的编码基因序列如SEQ ID No. 2中第1-285位核苷酸分子所示；所述 启动子Ppgk的核苷酸序列如SEQ ID No. 1中第1-793位核苷酸分子所示。
[0024] 本发明最后一个目的是提供上述所述生产乳铁蛋白的方法和/或上述所述的重 组菌在生产乳铁蛋白中的应用。
[0025] 本发明采用的酿酒酵母表达系统具有以下优点：生长速率快，易于高密度培养； 能表达分泌的蛋白，且产品易于分离纯化；具有多种翻译后修饰，如多肽折叠、糖基化、甲基 化、乙酰化等；遗传背景清楚，易于对表达载体进行操作。
[0026] 本发明提供了一种用酿酒酵母生产乳铁蛋白的方法。结果表明：本发明利用酿酒 酵母进行发酵得到的抗菌肽乳铁蛋白对大肠杆菌DH5ci有明显的抑菌作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图 1 为 pYES2-CPS_Blf 载体图。
[0028] 图2为启动子Ppgk基因的PCR扩增。
[0029] 图3为启动子Ppgk连T载体的酶切鉴定。
[0030] 图4为α -信号肽基因的PCR扩增。
[0031] 图5为α -信号肽基因连T载体的酶切鉴定。
[0032] 图6为乳铁蛋白基因的PCR扩增。
[0033] 图7为乳铁蛋白-T载体酶切鉴定。
[0034] 图8为载体pYES2_Ppgk转化大肠杆菌的酶切鉴定。
[0035] 图9为载体pYES2-CPS转化大肠杆菌的酶切鉴定。
[0036] 图10为pYES2-CPS_Blf载体转化大肠杆菌的酶切鉴定。
[0037] 图11为pYES2-CPS_Blf载体转化酿酒酵母的酶切鉴定。
[0038] 图12为表达蛋白Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳图。
[0039] 图13为乳铁蛋白活性鉴定。
【具体实施方式】
[0040] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0041] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042] 实施例1、启动子Ppgk、α -信号肽基因及乳铁蛋白基因的获得
[0043] 1、启动子Ppgk的获得
[0044] 以南阳K菌株（购于广东省微生物研究所）为模板，采用Ppgk-Fl和Ppgk_F2引物 (表 1)扩增启动子 Ppgk 基因 。PCR 反应条件：94°C 5min，94°C 30s-59°C 30s-72°C70s， 30个循环，72°C 7min。经2%琼脂糖凝胶电泳后，结果如图2所示，泳道M为marker,泳道 1和2为启动子Ppgk基因的PCR产物。
[0045] 回收纯化目的片段，保存于_20°C备用。将得到的Ppgk基因与T载体连接，转化大 肠杆菌DH5 α菌株，37°C下，用Age I和Pvu II双酶切筛选阳性菌株（图3)，送阳性菌液到 公司测序分析验证Ppgk序列的正确性。
[0046] 测序结果表明：启动子Ppgk的序列如序列1中第1-793位核苷酸所示，将连入 Ppgk序列的T载体记作Ppgk-T载体。
[0047] 2、α -信号肤基因的获得
[0048] 以质粒pPIC9K(购于长沙赢润生物技术有限公司）为模板，采用a -Fl和a -F2 引物（表1)扩增α-信号肽基因。PCR反应条件：94°C 5min，94°C 30s-59°c 30s-72°c 60s，30个循环，72°C 7min。经2%琼脂糖凝胶电泳后，结果如图4所示，在图4中，泳道M 为marker，泳道1和2为α -信号肽基因基因的PCR产物。
[0049] 回收纯化目的片段，保存于_20°C备用。将得到的α-信号肽基因与T载体连接， 转化大肠杆菌DH5 α菌株，37°C下，用Kpn I和Not I双酶切筛选阳性菌株（图5)，送阳性 菌液送公司测序分析α-信号肽基因序列的正确性。
[0050] 测序结果表明：α -信号肽基因的序列如序列2中第1-285位核苷酸所示，将连入 α -信号肽序列的T载体记作α -信号肽-T载体。
[0051] 3、乳铁蛋白基因的获得
[0052] 根据NCBI GenBank中乳铁蛋白成熟肽的基因序列，人工合成乳铁蛋白成熟肽的 DNA片段并将其保存于PMD19 Simple质粒。乳铁蛋白基因的序列如序列表3第1-105位 核苷酸所示，可通过人工合成得到。再根据其基因序列人工设计合成一对特异引物Blf Fl 和Blf F2(表1)，以PMD19 Simple质粒中为模板通过PCR技术克隆扩增乳铁蛋白（Lfcin B)基因片段。PCR 反应条件：94°C 5min，94°C 30s-56°C 30s-72°C 20s，30 个循环，72°C 7min。经2%琼脂糖凝胶电泳后，结果如图6所示，在图6中，泳道M为D2000marker，泳道 1-4为乳铁蛋白基因的PCR产物。
[0053] 回收纯化目的片段，保存于_20°C备用。将得到的乳铁蛋白基因与T载体连接，转 化大肠杆菌DH5a菌株，37°C下，用Not I和Xba I双酶切筛选阳性菌株（图7)，送阳性菌 液送公司测序分析验证乳铁蛋白基因序列的正确性。
[0054] 测序结果表明：Lfcin B基因的序列如序列4中第1-105位核苷酸所示，将连入 Lfcin B基因序列的T载体记作Blf-T载体。
[0055] 表1、引物序列
[0056]
【权利要求】
1. 一种生产乳铁蛋白的方法，包括如下步骤： (1) 构建重组菌：将表达盒导入宿主菌； 所述表达盒依次由启动子Ppgk、a-信号肽基因和乳铁蛋白Lfcin B的编码基因连接 而成； (2) 诱导培养所述重组菌，得到菌液； (3) 将所述菌液离心，收集上清；从上清中沉淀乳铁蛋白，即得到所述的乳铁蛋白。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述从上清中沉淀乳铁蛋白的方法为依 次用丙酮和三氯醋酸进行沉淀和浓缩。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述宿主菌为酿酒酵母INVScl。
4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述乳铁蛋白Lfcin B的氨基酸序 列如SEQ ID No. 5中第1-35位氨基酸所示；所述乳铁蛋白Lfcin B的编码基因序列如SEQ ID No. 4第1-105位核苷酸分子所示。
5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述a-信号肽的氨基酸序列如 SEQ ID No. 3中第1-95位氨基酸所示；所述a -信号肽的编码基因序列如SEQ ID No. 2中 第1-285位核苷酸分子所示；所述启动子Ppgk的核苷酸序列如SEQ ID No. 1中第1-793位 核苷酸分子所不。
6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：将所述表达盒导入酵母菌中的方 法为：将所述表达盒插入PYES2载体的多克隆位点，得到重组载体；再将重组载体导入所述 宿主酵母菌中。
7. -种重组菌，是将表达盒导入宿主菌获得的； 所述表达盒依次由启动子Ppgk、a-信号肽基因和乳铁蛋白Lfcin B的编码基因连接 而成； 所述宿主菌为酿酒酵母INVScl。
8. 根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述乳铁蛋白Lfcin B的氨基酸序列 如SEQ ID No. 5中第1-35位氨基酸所示；所述乳铁蛋白Lfcin B的编码基因序列如SEQ ID No. 4第1-105位核苷酸分子所示。
9. 根据权利要求7或8所述的重组菌，其特征在于：所述a -信号肽的氨基酸序列如 SEQ ID No. 3中第1-95位氨基酸所示；所述a -信号肽的编码基因序列如SEQ ID No. 2中 第1-285位核苷酸分子所示；所述启动子Ppgk的核苷酸序列如SEQ ID No. 1中第1-793位 核苷酸分子所不。
10. 权利要求1-6任一所述的方法和/或7-9任一所述的重组菌在生产乳铁蛋白中的 应用。
【文档编号】C07K14/79GK104313048SQ201410562115
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】夏新界, 许娜 申请人:长沙中科晶博生物科技有限公司