用于从乳纯化乳铁蛋白的改进方法及其产品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般涉及用于从乳纯化目标蛋白质的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 多年来来自家畜的乳已被用作蛋白质和其他用于食品和制药行业的产品的来源， 并且已知各种技术用于分离这些产品。乳是主要由脂肪、乳糖和水中的蛋白质组成的胶体 悬浮液。在反刍动物和实验室动物中，乳包含平均30至140克蛋白质/升，或按重量计约 4-17%，这取决于该物种。这些蛋白质的本体（bulk)是酪蛋白，它们与钙及磷酸盐复合成 被称为胶束的超分子结构。乳蛋白的其他主要种类是主要由乳球蛋白和a-乳清蛋白 组成的乳清蛋白，而且还包括乳铁蛋白、免疫球蛋白和血清白蛋白。
[0004] 通常通过包括膜过滤技术以及离子交换吸附方法在内的方法的组合分离乳蛋白。
[0005] 乳铁蛋白是天然地存在于生物液体中的80kD的铁结合糖蛋白，该生物液体如唾 液、胆汁、支气管粘液、胃肠液、宫颈-阴道粘液、精液和乳。乳铁蛋白的最丰富的来源是哺 乳动物乳和初乳。乳铁蛋白在脱脂牛乳中的浓度通常较低，典型地在80-200mg/ml之间，这 取决于各种因素，其包括脱脂乳的巴氏杀菌和其他预处理经历。在存在于乳中的酪蛋白沉 淀后，牛乳清中的乳铁蛋白的浓度典型地为l〇-l〇〇mg/ml，这取决于该乳清的物理和化学预 处理。
[0006] 乳铁蛋白具有多重假定生物学作用，包括调节铁代谢、免疫功能和胚胎发育。乳铁 蛋白具有针对一系列的病原体（包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌）和真菌（包括酵 母）的抗微生物活性。乳铁蛋白的抗微生物作用是基于其结合铁的能力，铁对病原体的生 长是必需的。乳铁蛋白还能抑制多种病毒的复制，并通过结合至细菌膜上的脂多糖的脂质 A组分来增加一些细菌对抗生素和溶菌酶的敏感性。
[0007] 本发明的优选实施方案的目的是提供用于从乳、特别是牛乳纯化乳铁蛋白的改进 方法，以提高纯度。
[0008] 本说明书中引用的所有参考文献（包括任何专利或专利申请）通过引用并入本 文。应当清楚地理解，虽然在本文中引述了许多现有技术出版物，此引用并非承认这些文献 中的任一个构成本领域公知常识的一部分。
[0009] 概述
[0010] 第一方面提供了用于从乳纯化乳铁蛋白的方法，该方法包括对乳进行过滤以将乳 分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/或RNA酶的渗透物级分，其中，在过 滤之前和/或过滤期间对乳进行盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入渗透物中。
[0011] 当使用具有30kD或50kD的截断值的膜过滤从乳纯化乳铁蛋白时，本发明人发现 乳铁蛋白残余物被生长因子和RNA酶污染。由于这些生长因子和RNA酶具有小于30kD的分 子量，因此它们应已通过膜并进入渗透物中，而且不应作为残余的乳铁蛋白级分中的杂质 存在。因此，生长因子和RNA酶在残余物中的发现是令人惊讶的。带着进一步纯化乳铁蛋 白级分的目的，本发明人发现，在过滤之前加入大量的盐从残余物中除去了生长因子和RNA 酶，从而进一步纯化乳铁蛋白。在盐条件下，生长因子和RNA酶被发现于渗透物中。
[0012] 不希望受理论的束缚，本发明人提出在正常条件下，乳中的RNA酶和生长因子聚 集或以其他方式形成比它们各自的分子量都大的质量。提出了盐处理导致RNA酶和生长因 子解聚或解离。
[0013] 因此，在可选形式中，第一方面的方法提供了用于从乳纯化乳铁蛋白的方法，其包 括对乳进行过滤以将乳分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/或RNA酶的 渗透物级分，其中，在过滤之前和/或过滤期间对乳进行能够解聚或解离任何质量的RNA酶 或生长因子的盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入渗透物中。
[0014] 不希望受理论的束缚，本发明人可选地提出了在低离子强度的条件下，蛋白质聚 集体可能变得与膜相关联，从而形成表观孔尺寸小于该膜的表观孔尺寸的层，该层防止乳 中的RNA酶和生长因子穿过该膜。提出了盐处理防止蛋白质层的形成或去除，允许任何RNA 酶和生长因子穿过该膜进入该渗透物中。
[0015] 因此，在可选形式中，第一方面的方法提供了一种用于从乳纯化乳铁蛋白的方法， 该方法包括对乳进行膜过滤以将乳分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/ 或RNA酶的渗透物级分，其中，在过滤之前和/或过滤期间对乳进行能够使任何RNA酶或生 长因子与膜分离的盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入渗透物中。
[0016] 第二方面提供了由第一方面的方法获得的乳铁蛋白。
[0017] 在一个实施方案中，对第二方面的乳铁蛋白进行进一步纯化。
[0018] 第三方面提供了第二方面的乳铁蛋白作为抗癌剂、抗病毒剂、抗微生物剂或抗炎 剂的用途，该用途用于治疗包括癌症的增殖性病症，特别是涉及实体瘤的那些癌症，用于治 疗恶性肿瘤和过度增殖性疾病，用于通过促进骨生成治疗骨骼病症，用于治疗病毒或微生 物感染，用于角膜伤口治疗，用于增强免疫力，用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤，用于治疗 败血性休克，用于通过改善双歧数目来改善肠道健康同时减少大肠杆菌、链球菌和梭菌，用 于治疗IBD，用于提升免疫力和抗病能力，用于控制系统炎症，用于防止器官移植排斥反应 和移植物抗宿主病，用于改善孕产妇和胎儿健康，用于改善神经元健康和婴儿肠道发育，用 于减少尤其是具有血铁过少症或缺铁性贫血的妇女中的妊娠并发症的可能性，如先兆子 痫、早产、妊娠糖尿病、流产、宫内胎儿死亡、早产、低出生体重、胎盘早剥和宫内生长受限， 用于治疗尤其是孕妇中的缺铁和贫血，用于预防早产儿中的新生儿败血症，用于伤口愈合， 用于促进生物膜的形成，用于治疗包括牙周炎的口腔感染，用于治疗糖尿病性溃疡，用于囊 性纤维化的治疗，用于减轻疼痛，用于治疗蛋白尿症，用于促进皮肤细胞的生长，用作辐射 防护剂，用于泌尿道感染的治疗，用于退行性关节疾病的治疗，用于糖尿病的治疗，用于呼 吸系统病症的治疗，用于降低循环胆固醇、血管炎症、动脉粥样硬化和心血管疾病，以及用 于本领域技术人员已知的乳铁蛋白的所有其他用途。
[0019] 在可选形式中，第三方面提供了由第一方面的方法获得的乳铁蛋白，其用于如第 三方面中提出的用途或用于制造用于如第三方面中提出的用途的药物。
【附图说明】
[0020] 图1示出了穿过50kDa的膜的渗透物通量随电导率增加而增加。
[0021] 图2示出了在增加的氯化钠的存在下的超滤通过增加低分子量污染物（用作实例 的RNA酶）的渗透而提高了截留的乳铁蛋白的纯度。
[0022] 图3示出了在来自50kDa的UF膜的渗透物中的乳铁蛋白（'#')、低分子量蛋白质 (用作实例的RNA酶，）和蛋白质（▲)的浓度。
[0023] 图4A、4B、4C和4D示出了在浓度增加的氯化钠中的乳铁蛋白的尺寸排阻HPLC分 析，显示出增加的浓度使大颗粒解聚。在最初的50分钟内，氯化钠浓度是四个谱图之间的 重要区别：A，0MNaCl;B，0. 16MNaCl;C，0. 32MNaCl和D，0. 48MNaCl。
[0024] 图5A和图5B示出了通过被保持在Vivacell装置中的50kDa的膜的乳铁蛋白溶 液在氯化钠（〇、1.5、3、4、5或6%NaCl)的存在下的超滤，显示出在氯化钠的存在下，50kDa 的膜选择性地允许RNA酶和其他生长因子的传输。A:渗透物样品；B，渗透物样品。
[0025] 图6A和图6B示出了通过被保持在Vivacell装置中的50kDa的膜的乳铁蛋白溶 液在氯化钠（〇、1.5、3、4、5或6%NaCl)的存在下的超滤，显示出在氯化钠的存在下，50kDa 的膜选择性地允许RNA酶和其他生长因子的传输。A:渗透物样品；B，渗透物样品。
[0026] 图7示出了在存在增加的电导率下的超滤提高了被截留的乳铁蛋白的纯度。
[0027] 图8示出了观察到的增加的乳铁蛋白的纯度是由于污染生长因子（如RNA酶）的 传输增加所导致。生长因子传输在〇mS和20mS之间迅速增加。
[0028] 图9示出了乳铁蛋白起始材料、主要的阳离子交换色谱峰以及通过50kDa的UF进 一步纯化的材料中的乳铁蛋白纯度。目标乳铁蛋白纯度为98 %。
[0029] 图10示出了在用50kDa的膜处理的期间乳铁蛋白纯度的增加。以液体形式通过 阳离子HPLC分析的样品以灰色表示，而以粉末形式通过阳离子交换HPLC分析的样品以黑 色表示。
[0030] 图11示出了当通过超滤处理含氯化钠的乳铁蛋白溶液时，增加的膜分子量截断 值允许更多量的蛋白质进入渗透物（▲)中，并改善蛋白质（…ir)和乳铁蛋白（ )的截留。结果已通过测试用具有所示孔隙率的SartoriusStediumVivacell250UF膜分 离含6%的氯化钠的2mg/mL的乳铁蛋白溶液获得。
[0031] 图12示出了膜的通量随分子量截