0分钟增加至16%缓冲液B。在每个随 后的试验中，在0分钟至50分钟以及90分钟至150分钟之间，该盐增加了 16%B。
[0102] 如图4所示，乳铁蛋白在约28分钟时以单一的主峰、之后是几个较小的峰洗脱，较 小的峰包括乳铁蛋白片段和非乳铁蛋白。含0.48MNaCl的谱图D显示出典型的乳铁蛋白 分布的实例。不含NaCl的谱图A示出了较小的乳铁蛋白的峰的存在以及在94分钟时较大 的峰。在94分钟时的峰是不溶性乳铁蛋白，直到开始于50分钟时的较高的盐解离聚集的 乳铁蛋白，并允许该乳铁蛋白通过包含在柱中的树脂床移动。
[0103] 图4中示出的结果证实了盐解离以95%的乳铁蛋白粉末存在的蛋白质，但是被解 离的蛋白质不一定是乳铁蛋白，并导致将通过50kDa的膜的单个的蛋白质。结果表明，大于 0. 32M的NaCl对于发生解离作用而言是必需的。
[0104] 已经通过液体样品重复了实验并观察到类似的结果。
[0105] 实施例3 :乳铁蛋白的超滤以去除小分子并提高乳铁蛋白纯度
[0106] 将六个Vivacell250单元（Sartorius)装有50kDa的膜。用lmg/mL的乳铁蛋白 溶液将每一个填充到250mL系（line)，但是每一个具有不同的氯化钠浓度（0、1. 5、3、4、5或 6%NaCl)。将细胞加压至3巴。收集残余物和渗透物的样品并通过阳离子交换HPLC分析。
[0107] 发现增加的盐浓度提高了生长因子的传输（作为代表物的RNA酶），并增加了残余 物中的乳铁蛋白的纯度（图5和图6)。
[0108] 实施例4 :乳铁蛋白的超滤以去除小分子并提高乳铁蛋白纯度
[0109] 将超滤设备装有6英寸的50kDa的膜（Synder)，然后稳定化，使得基线压力为 3. 2-3. 4巴且跨膜压力为1. 2-1. 4巴。将乳铁蛋白溶液（2mg/mL)溶液分成六个2L的批次。 在六次除了电导率（0、20、40或60mS)之外都相同的实验中，将2L的乳铁蛋白溶液加入到 UF进料罐，用水覆盖至170L并通过加入氯化钠溶液调节到指定的电导率。残余物被回收至 进料罐并收集渗透物。用具有相同电导率的渗滤溶液代替被去除的渗透物。通过阳离子交 换HPLC评估纯度。
[0110] 乳铁蛋白纯度从90.9 % (OmS)增加至93.5 % (60mS)(图7)，这表示纯度增加了 2. 5%。乳铁蛋白纯度的增加是通过选择性去除生长因子（用作实例的RNA酶，图8)实现 的。
[0111] 实施例5 :在有或无超滤下使用二级阳离子交换色谱以改善增加的乳铁蛋白纯度
[0112] 通过Stomacher将乳铁蛋白粉末（40g，95. 2 %的乳铁蛋白）溶解在水（200mL)中。 收集样品并通过阳离子交换HPLC分析。将乳铁蛋白溶液施加到填充有SPFastFlow树脂 (GEHealthcare)的柱（50mmDX1000mmL)。结合的乳铁蛋白从具有从0%至5.8% (1M)范 围的氯化钠的3L线性梯度的树脂洗脱。收集主要的乳铁蛋白峰并通过阳离子交换HPLC分 析。
[0113] 将少量的主要的乳铁蛋白峰（5mL)置于离心机驱动的50kDa的UF设备 (SartoriusStedim)中，用水稀释到3倍的初始体积（15mL)，离心（8, 000gX20分钟）直 至1. 5mL的乳铁蛋白被截留并最终通过阳离子交换HPLC分析。
[0114] 阳离子交换色谱和50kDa的UF组合得到98. 9%的纯度，这超过了所需要的98% 的蛋白质纯度，这是单独使用色谱法（97. 8% )做不到的（图9)。阳离子交换色谱使乳铁 蛋白的纯度提高了 2. 7%，并且随后的50kDa的UF步骤使纯度进一步提高了 0.9%。给人 希望地，50kDa的UF提高了纯度（即使在已经非常纯净的材料中），并且显示出50kDa的UF 本身就值得试用。
[0115] 实施例6 :初始实验以确定是否乳铁蛋白的超滤可以充分地增加乳铁蛋白纯度
[0116] 将乳铁蛋白粉末（1kg，纯度为96. 3%的蛋白质）溶解在100L的水中。将乳铁蛋白 溶液置于装有单个的Synder6. 3"的50kDa的膜（BX-5XB-6338)的APVUF设备中。乳铁蛋 白溶液和存在于UF设备中的水的总体积为180L，并且因加入的氯化钠导致电导率为58mS。 在10分钟内去除渗透物（100L)。加入水（100L)和盐以获得121mS的电导率。在10分钟 内去除渗透物（100L)。之后通过水渗滤（400L渗透物）将乳铁蛋白残余物的电导率降低到 1300yS。然后将乳铁蛋白残余物冷冻干燥（48h，1毫巴，40°C)。通过阳离子交换HPLC在 MGC分析液体样品，并且通过外部实验室经由阳离子交换HPLC分析粉末样品（以粉末形式 分析的样品应被认为是更准确的）。
[0117] 当在装有50kDa的膜的UF设备中已发生充分的渗滤时，乳铁蛋白纯度可提高约 2% (基于蛋白质）。最终的纯度结果为98.1% (基于蛋白质）（图10)，这表明该过程可能 是可行的，而且进一步的发展是必要的。
[0118] 实施例7 :膜分子量截断值对膜性能的影响
[0119] 膜分子量截断值（MWC0)是膜性能的最重要的影响因素。当膜的孔尺寸增加时，该 膜允许较大的蛋白质通过（图11)并且通量增加（图12)。膜具有分离混合物中的组分的 能力，但只有当一种或一些组分小于膜MWC0以及一种或一些组分大于膜MWC0时。在一般 情况下，对于理想的分离而言，需要至少两个数量级的分子量差（即28Da的水和58Da的氯 化钠可以几乎完全与78kDa的乳铁蛋白分离），但当这样的显著尺寸差不存在时有些分离 也是可能的。如果目的是提高乳铁蛋白溶液的纯度，则50kDa的膜显示出是可用的最佳选 择（图13)。
[0120] 实施例8:超滤膜
[0121] UF4
[0122] 类型：螺旋缠绕聚醚砜（PES)MWCO:30kDa
[0123] 品牌：Synder 型号：MK2B-6338
[0124] 被称为UF4的超滤设备用于：
[0125] 1.浓缩从阳离子交换柱洗脱的乳铁蛋白，以及
[0126] 2.将乳铁蛋白洗脱盐回收至6%的盐罐以重新用在色谱法中。
[0127] 在更广泛的乳铁蛋白制造方法内的方法可行性：
[0128] -氯化钠（2,000kg/批次）是乳铁蛋白制造方法中的主要成本（$1，200元/批 次），而回收氯化钠的能力显著地降低了生产成本。
[0129] -通过回收氯化钠降低了对环境的损害。在Leongatha的三级处理以除去有机固 体之后，含氯化钠的流出物通过海洋排水口处置，并且必须采取的所有步骤，以减少产生的 废物量。盐回收过程减少了所需盐量的80%，这意味着被释放到环境中的氯化钠的量减少 了 8, 000kg/批次（三分之二是因UF4导致）。
[0130] 膜类型的可行性：
[0131] -螺旋膜是获得大面积的膜的相对便宜的方式，其在具有较小足迹的设备中实现 了高通量。
[0132] -PES是迅速且完全地浸湿的固有亲水膜，导致具有优异的流速和高吞吐量的快速 过滤。PES膜还是极其低的蛋白质结合，以将靶向蛋白质结合的可能性降至最低，这意味着 高产率、稳定的跨膜通量和一致的表观膜孔隙率。
[0133] MWC0的可行性：
[0134] _30kDa的膜成功地截留了收获的乳铁蛋白（通过该膜的蛋白质传输是存在的蛋 白质的0.6% )，其通过允许重要的污染物（特别是RNA酶）通过该膜来提高纯度。
[0135] -氯化钠（58Da)未被30kDa的膜截留，而乳铁蛋白（80kDa)被该膜截留，为此，从 柱上洗脱的低浓度（0. 1%的蛋白质）的乳铁蛋白可被浓缩至3%的蛋白质，在盐浓度或蛋 白质损失中无相应的增加。
[0136] UF5
[0137] 类型：螺旋缠绕聚醚砜（PES)MWCO:5kDa
[0138] 品牌：Synder 型号：MT2B-6338
[0139] 被称为UF5的超滤设备用于：
[0140] 1.浓缩从阳离子交换柱洗脱的乳铁蛋白，以及
[0141] 2.将2. 5%的盐回收至2. 5%的盐罐以重新用在色谱法中。
[0142] 在更广泛的乳铁蛋白制造方法内的方法可行性：
[0143] -氯化钠（2,000kg/批次）是乳铁蛋白制造方法中的主要成本（$1，200元/批 次），而回收氯化钠的能力显著地降低了生产成本。
[0144] -通过回收氯化钠降低了对环境的损害。在Leongatha的三级处理以除去有机固 体之后，含氯化钠的流出物通过海洋排水口处置，并且必须采取的所有步骤，以减少产生的 废物量。盐回收过程减少了所需盐量的80%，这意味着被释放到环境中的氯化钠