专利名称：一种酵母表达的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种牛乳铁蛋白衍生来源的抗菌蛋白片段的真核表达及其产品制备方法。
背景技术：
乳铁蛋白(lactoferrin，Lf)是一种天然非血红素铁结合糖蛋白，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中，是哺乳动物非特异性免疫和获得性免疫反应重要的介导分子。乳铁蛋白是一个多效性的分子，除全长蛋白的铁离子结合能力外，乳铁蛋白及其降解产物如N-lobe、C-lobe、N-端抗菌肽——乳铁蛋白肽和乳铁蛋白两亲肽等衍生片段在广谱抗菌、抗炎症反应、抑制肿瘤生长、调节免疫动态平衡、转录调节、蛋白和核糖核酸酶作用等过程中起直接辅助作用，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品、化妆品和饲料添加剂。根据蛋白药物分子设计原理和方法，本发明以抗金黄色葡萄球菌为目标，以牛乳铁蛋白作为出发抗菌蛋白模板，创新性设计筛选和高效表达具有特异性抗金黄色葡萄球菌活性的抗菌多肽片段，具有重要的人与动物临床和预防医学意义。金黄色葡萄球菌是人和动物的重要病原菌之一，常引起鼻腔、口腔粘膜以及皮肤和上皮组织的感染，在兽医临床主要引起牛、羊的乳房炎，犬、猫的鼻炎、外耳炎，猪的败血症，鸡的水肿症等。金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性球菌病对养殖业造成巨大的经济损失，对公共卫生尤其是相关从业人员的生命安全构成严重威胁。此外，乳铁蛋白完整分子的工业化和商业化应用也已取得了很大进展，已成为目前国内外研究的热点。美国食品药品管理局已于2001年批准乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动和功能性食品中，其抗金黄色葡萄球菌的特异性和活性都不是很高，难以满足临床和预防医学的实际需求。而小分子量抗菌肽的制备和纯化存在分离成本很高，价格昂贵，一时难以推广普及满足生产需求。应用基因工程技术在体外高效表达重组乳铁蛋白衍生抗菌片段，提高表达量和结构稳定性，有望为解决抗菌肽替代抗生素这一问题提供了有效思路。
发明内容
本发明提供的牛乳铁蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表达及其产品制备方法的目的在于开展牛乳铁蛋白衍生抗菌分子BLfA的设计筛选、重组毕赤酵母构建和转抗菌蛋白酵母的高密度发酵研究，以突破乳铁蛋白外源表达、翻译后修饰及重组蛋白纯化的技术瓶颈，获得安全、环保、高产、高效的基因工程重组乳铁蛋白及其衍生抗菌蛋白，推进新型抗菌蛋白的工业化应用进程。同时将为新型抗菌蛋白的分子设计、构效关系研究和乳源抗菌蛋白产业化提供理论支持。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。以牛乳铁蛋白分子序列为出发模板，借助计算机辅助设计手段，通过分子设计选定抗金黄色葡萄球菌导向的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA基因序列，全长1032个碱基，编码344个氨基酸残基，利用毕赤巴斯德酵母进行真核表达、包括可能发生的糖基化修饰在内，推算表达产生的重组蛋白分子量约为43KD。牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA序列及其推导的氨基酸序列为
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341 ARYT本发明提供的牛乳铁蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表达及其产品制备方法，其步骤如下1、从荷斯坦奶牛乳腺组织中克隆了 BLf全长cDNA ；2、以BLf全长cDNA为模板，设计引物PCR扩增了 BLfA编码基因；3、构建了 Pichia. pastoris重组表达载体pPICBLfA，BLfA在毕赤酵母摇瓶水平得到分泌表达，在甲醇诱导30h后达摇瓶水平最大表达量485mg/L;rBLfA经Ni-NTA His-Bind 树脂纯化后纯度为93. 8% ；重组蛋白的去糖基化反应结果显示，rBLfA被糖基化修饰，表观分子量为43. OkDa ；4、进行 rBLfA 的 Fe3+结合能力为 0. 330，rBLfA释放!^e3+的 pH 范围为 pH 7. 0-3. 5 ；5、rBLfA抑菌活性测定结果显示，rBLfA具有抑制金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus. aureus 白勺功倉泛，MIC 为 6· 5 μ mol/L ；6、表达rBLfA的重组菌株经过5升发酵罐水平上的高密度发酵，分泌的目标蛋白质产量达到499mg/L，利用透明颤菌血红蛋白VHb在宿主菌胞内与rBLfA共表达，使 rBLfA发酵罐水平的表达量提高了 23%，达6i;3mg/L，CO差光谱的结果表明，VHb在重组菌 X-33 (rBLfA-VHb)中得到了有效的表达。采用本发明的方法生产的产品在医药、化妆品、食品、饲料等行业有广阔的应用前景，提高机体免疫力，替代抗生素。本发明的优点体现在UBLfA基本保持了其在天然牛乳铁蛋白中的原有结构，并具有4个牛乳铁蛋白分子中最强的分子表面阳离子特性。脱铁(apo)的rBLfA和rBLf均可导致金黄色葡萄球菌 S. aureus ATCC 25923的存活率下降，具有延缓S. aureus生长的作用，其中rBLfA的抑生长作用优于对照产品牛乳铁蛋白(纯度为90%，Sigma, L9507)。2、甲醇营养型毕赤酵母对甲醇的利用过程中，溶解氧的传递极为重要。Vgb的异源表达能改善重组毕赤酵母细胞内部氧的储存与传递。VHb在重组菌X-33 (rBLfA-VHb)中的表达具有促进摇瓶和发酵罐水平重组菌的生长状况及rBLfA合成能力的作用，使rBLfA发酵罐水平的表达量提高了 23%，达6i;3mg/L。3、由于抗菌肽分子量小，在构建重组载体和重组蛋白分离纯化时难度大，表达量不高，融合蛋白切割效率低，以及阳离子性和溶血性较强，多聚体毒性高等抗菌肽本身的特殊性质限制了其产业化进程。本研究的牛乳铁蛋白衍生抗菌分子BLfA重组毕赤酵母细胞高密度发酵突破了乳铁蛋白外源表达、翻译后修饰及重组蛋白纯化的技术瓶颈，能够获得安全、环保、高产、高效的基因工程重组乳铁蛋白衍生抗菌蛋白，以期推进新型抗菌蛋白的工业化应用进程。
图IrBLfA和对照牛乳铁蛋白的抑菌效果图2重组蛋白的SDS-PAGE电泳图3重组蛋白的纯化图4WeStern blot分析重组蛋白的去糖基化
图5重组菌的CO差光谱分析下面结合附图对本发明做进一步说明。图IrBLfA和对照牛乳铁蛋白的抑菌效果，为rBLfA和对照牛乳铁蛋白37°C分别作用Ih后金黄色葡萄球菌S. aureus ATCC 25923的存活率(CFU/mL)，其中样品为Apo rBLfA 和Apo对照牛乳铁蛋白，处理浓度分别为0,3. 13，6. 25，12. 5，25和50μ mol/L图2重组蛋白的SDS-PAGE电泳，为重组菌X_33 (rBLfA-VHb)和X_33 (rBLfA)发酵罐水平表达rBLfA (A，B)，其中泳道1为蛋白质分子量标准，从上至下依次为66. 2，45. 0， 33. 0,26.0, 20. OkDa ；泳道2-9分别为诱导时间为12，24，36，48，60，72小时的发酵重组蛋白产物。图3重组蛋白的纯化，为毕赤酵母表达重组蛋白rBLfA的纯化，其中泳道1为蛋白质分子量标准，从上至下依次为94. 0，66. 2，45. 0，33. 0,26. 0,20. 0,14. 4kDa ；泳道2-4分别为镍柱纯化后rBLfA蛋白。
图4WeStern blot分析重组蛋白的去糖基化，为flfestern blot分析毕赤酵母表达重组蛋白rBLfA的去糖基化，兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗血清作为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗兔作为二抗，其中泳道1为预染蛋白质分子量标准，从上至下依次为89. 0，45. 0，34. 0， 25. 0，19. OkDa ；泳道2为rBLfA ；泳道3为经过Endo H处理的rBLfA。
图5重组菌的CO差光谱分析，为重组菌X-33 (rBLfA-VHb)的CO差光谱分析，图中横坐标为波长，纵坐标为吸光值。 具体实施例方式本发明提供的一种牛乳铁蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表达及其制备方法的具体实施方式
如下1、从荷斯坦奶牛乳腺组织中克隆了 BLf全长cDNA ；使用Trizol试剂提取牛乳腺组织总RNA，以荷斯坦奶牛乳腺组织总RNA为模板，两步法RT-PCR扩增BLf cDNA全长分子，第一步为反转录，即合成第一链cDNA，RT-PCR第二步为PCR扩增，以第一链cDNA为模板进行 PCR 扩增，特异性引物序列为Pl :gTCCCATggCCCCgAggAAAAACgTTCgATggTgTA ；P2 ACgTCgACCCCTCgTCAggAAggCgCAg。2、以BLf全长cDNA为模板，设计引物PCR扩增了 BLfA编码基因，引物为P1 ggAATTCgCCCCgAggAAAAACg ；P2 gCTCTAgAgCCCTggTgTACCgCgCCTTCA 3、构建了 P. pastoris重组表达载体pPICBLfA，用限制性内切酶Rne I线性化，将线形化的重组载体回收纯化，分别电击转化P. pastoris X-33感受态细胞。4、BLfA在毕赤酵母摇瓶水平得到分泌表达，在甲醇诱导30h后达摇瓶水平最大表达量485mg/L ；rBLfA经Ni-NTA His-Bind树脂纯化后纯度为93. 8%;兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗血清作为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗兔作为二抗，进行了 SDS-PAGE和Western Blot 分析重组蛋白的糖基化，结果显示，rBLfA被糖基化修饰，表观分子量为43. OkDa ；5、rBLfA的!^3+结合能力测定(1)将铁饱和重组蛋白通过超滤置于pH值分别为7.0，6. 5，6.0，5. 5，5.0，4. 5， 4. 0,3. 5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，4°C静置Mh ；(2)超滤去除多余的盐及铁离子；(3)酶标仪测定465nm处光吸收值，以对照牛乳铁蛋白铁饱和状态(pH8. 0)下0D465nm值为100%，估算出不同pH条件下rBLFA的铁饱和度。rBLfA 的 Fe3+ 结合能力为 0. 330，rBLfA 释放 Fe3+ 的 pH 范围为 pH 7. 0-3. 5。6、rBLfA的抑菌活性检测(1)甘油管保存的金黄色葡萄球菌(S. aureus ATCC 25923)在MHB平板划线，于 37 °C活化培养；(2)挑取单菌落，37 °C，240rpm振荡过夜培养至0D600nm为 0. 2-0. 4(7. 2 X 108-1. 44 X 109CFUs/mL)；(3)收集1. 5mL菌液，等体积生理盐水洗涤两次，重悬于等体积生理盐水中；(4)将倍比稀释后不同浓度的待测抗菌样品溶液100 μ L分别加到灭菌的96孔板中，浓度分别为50，25，12. 5,6. 25 ( μ mol/μ L)，阳性对照为50 μ mo 1/LAmp,阴性对照为生理盐水；(5)向每孔中加ΙΟΟμΙ菌液，密封后置37°C中孵育lh。样品的终浓度为6，3，1.5， 0. 75 ( μ g/ μ L)；(6)将温育后的样品梯度稀释为10-4、10_5、10-6，各取50 μ L，涂平板；(7)待菌液吸收后，封口，倒置，370C，静置培养至出现菌落，菌落计数，计算CFU。rBLfA的抑菌活性检测结果显示rBLfA具有抑制金黄色葡萄球菌S. aureus生长的功能，MIC 为 6. 5ymol/L;7、表达rBLfA的重组菌株进行了细胞高密度发酵，产量为499mg/L，利用透明颤菌血红蛋白VHb在宿主菌胞内与rBLfA共表达，使rBLfA发酵罐水平的表达量提高了 23 %，达 613mg/L。8、重组菌X-33 (rBLfA-VHb)的CO差光谱测定(1)使VHb在过量的Naj2O4的还原作用下由原始状态转变为还原态；(2)向预处理后的X-33 (rBLfA-VHb)的无细胞提取液中通入CO气体，溶液逐渐由无色变为浅红色；(3)分光光度计扫描、计算、分析400-500nm之间的差光谱。CO差光谱的结果表明，整合有vgb基因的X-33 (rBLfA-VHb)的无细胞提取液样品在419nm处有一明显的波峰出现，而对照组X_33 (rBLfA)则无特征性波峰出现，证明VHb在重组菌X-33 (rBLfA-VHb)中得到了有效的表达。
权利要求
1.一种酵母表达的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA，其特征是具有4个牛乳铁蛋白分子中最强的分子表面阳离子特性，其中牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA基因的核苷酸序列为1 ATGGCCCCGAGGAAAAACGTTCGATGGTGTACCATCTCCCAACCTGAGTGGTTCAAATGC 61 CGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTCCCTCTATCACCTGTGTGAGGAGG 121 GCCTTTGCCTTGGAATGTATCCGGGCCATCGCGGAGAAAAAGGCGGATGCTGTGACCCTG 181 GATGGTGGCATGGTGTTTGAGGCGGGCCGGGACCCCTACAAACTGCGGCCAGTAGCAGCA 241 GAGATCTATGGGACGAAAGAGTCTCCCCAAACCCACTATTATGCTGTGGCCGTCGTGAAG 301 AAGGGCAGCAACTTTCAGCTGGACCAGCTGCAAGGCCGGAAGTCCTGCCATACGGGCCTT 361 GGCAGGTCCGCTGGGTGGATCATCCCTATGGGAATCCTTCGCCCGTACTTGAGCTGGACA 421 GAGTCACTCGAGCCCCTCCAGGGAGCTGTGGCTAAATTCTTCTCTGCCAGCTGTGTTCCC 481 TGCATTGATAGACAAGCATACCCCAACCTGTGTCAACTGTGCAAGGGGGAGGGGGAGAAC 541 CAGTGTGCCTGCTCCTCCCGGGAACCATACTTCGGTTATTCTGGTGCCTTCAAGTGTCTG 601 CAGGACGGGGCTGGAGACGTGGCTTTTGTTAAAGAGACGACAGTGTTTGAGAACTTGCCA 661 GAGAAGGCTGACAGGGACCAGTATGAGCTTCTCTGCCTGAACAACAGTCGGGCGCCAGTG 721 GATGCGTTCAAGGAGTGCCACCTGGCCCAGGTCCCTTCTCATGCTGTCGTGGCCCGAAGT 781 GTGGATGGCAAGGAAGACTTGATCTGGAAGCTTCTCAGCAAGGCGCAGGAGAAATTTGGA 841 AAAAACAAGTCTCGGAGCTTCCAGCTCTTTGGCTCTCCACCCGGCCAGAGGGACCTGCTG 901 TTCAAAGACTCTGCTCTTGGGTTTTTGAGGATCCCCTCGAAGGTAGATTCGGCGCTGTAC 961 CTGGGCTCCCGCTACTTGACCACCTTGAAGAACCTCAGGGAAACTGCGGAGGAGGTGAAG 1021 GCGCGGTACACC
2.一种制备权利要求1所述的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA的制备方法，其特征是(1)从荷斯坦奶牛乳腺组织中克隆了BLf全长cDNA ；以BLf全长cDNA为模板，设计引物PCR扩增了 BLfA编码基因；(2)构建了Pichia. pastoris重组表达载体pPICBLfA，BLfA在毕赤酵母摇瓶水平得到分泌表达，在甲醇诱导30h后达摇瓶水平最大表达量485mg/L ；rBLfA经Ni-NTA His-Bind 树脂纯化后纯度为93. 8% ；重组蛋白的去糖基化反应结果显示，rBLfA被糖基化修饰，表观分子量为43. OkDa ；(3)表达的rBLfA的重组菌株进行了细胞高密度发酵，产量分别为499mg/L，利用透明颤菌血红蛋白VHb在宿主菌胞内与rBLfA共表达，使rBLfA发酵罐水平的表达量提高了 23%，达6i;3mg/L，CO差光谱的结果表明，VHb在重组菌X_33 (rBLfA_VHb)中得到了有效的表达。结果，rBLfA的Fe3+结合能力为0. 330，rBLfA释放Fe3+的pH范围为pH 7. 0-3. 5 ；rBLfA 具有抑制金黄色葡萄球菌Maphyloccocus. aureus生长的功能，MIC为6. 5 μ mol/L。
全文摘要
本发明涉及的是一种基因工程抗菌蛋白的制备方法，具体地说是一种牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA的真核表达蛋白及其制备方法。从荷斯坦奶牛乳腺组织中克隆了BLfA编码基因并构建重组表达载体，实现其在毕赤酵母中表达，摇瓶和5升发酵罐最大表达量分别为485和499mg/L；利用透明颤菌血红蛋白VHb在宿主菌胞内与rBLfA共表达，表达量提高了23％，达613mg/L；rBLfA经亲和纯化，纯度为93.8％；铁结合实验表明，rBLfA的Fe3+结合能力为0.330，释放Fe3+的pH范围为7.0-3.5；rBLfA具有抑制金黄色葡萄球菌生长的功能，MIC为6.5μmol/L。
文档编号C07K14/79GK102408480SQ20101028687
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月20日 优先权日2010年9月20日
发明者杨雅麟, 滕达, 王建华, 白雪晶 申请人:中国农业科学院饲料研究所