专利名称：一种重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的生产方法
技术领域：
本发明涉及蛋白纯化领域，具体地说，涉及一种重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)成熟肽的纯化生产方法。
背景技术：
1965ip, E^Urist (Urist MR. Bone format ion byautoinduction. Science, 1965,150(698) :893-899)发现脱钙的骨间质有异位成骨作用，并将新发现的具有诱导新骨形成的蛋白质命名为骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic protein,BMP) 0随后，又发现了众多的BMP，除了 BMP-1，它们都是TGF-beta超家族成员，无论在基因或者蛋白质结构上，还是在生物学功能上都非常相似。其中BMP-2的成骨作用研究的最多，产业化研究也最为广泛。人BMP-2全长为396个氨基酸残基，具有成骨作用的是成熟肽，由114个氨基酸组成，在55位的天冬酰胺残基上有糖基化位点，但是糖基化与否并不影响其生物活性。此外BMP-2疏水性很强，几乎不溶于各种溶剂，其活性形式以二聚体形式存在，其中单体各形成3对二硫键，在两个单体之间形成一对链间二硫键。二硫键的正确配对与否直接影响其生物活性和稳定性。体内外试验证明BMP-2具有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力(Riley, EH ；Lane, JM ；Urist, MR, et al. Bone morphogenetic protein-2 :Biology and applications. ClinOrthop Relat Res. 1996Mar ； (324) :39-46)。但是天然的 BMP-2 在各种组织中的含量极低，需要采用基因重组的方法进行大量生产。在BMP-2的产业化研究方面，主要是真核表达载体和大肠杆菌为代表的原核表达体系两种基因重组方案。真核表达载体国内还未实现产业化，1988年，wozney等(Wozney J. Μ. , Rosen V., Celeste A. J. etal. Novel regulators of bone formation :molecular clones and activities. Science 16 December 1988 ;242 0885) :1528-1534.)获得了 C0S-1 真核表达的 BMP-2 ； 1992 年，Israel DI 获得了 CHO 真核表达的 BMP-2 (Israel DI, Nove J, Kerns KM, Moutsatsos IK, Kaufman RJ. Expressionand characterization of bone morphogenetic protein-2 in Chinese hamsterovary cells. Growth Factors 1992 ；7 :139-50)；美国 Medtronic SofamorDanek 公司研制的 INFUSE 骨移植剂和 LT-CAGE 腰椎融合器械在2002年7月获得FDA批准用于治疗椎间盘退行性疾病(McKay WF, Peckham SM, Badura JM. A comprehensive clinical review ofrecombinant human bone morphogenetic protein-2(INFUSE Bone Graft). Int Orthop. 2007 Dec ；31 (6) :729-34)； Wyeth公司开发的hductOs(TM) (rhBMP-2/ACS)于2002年9月获得欧洲委员会(EC)的批准，用于成人急性胫骨骨折的治疗(Govender S, Csimma C, GenantHK, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 fortreatment of open tibial fractures -.a prospective, controlled, randomizedstudy of four hundred and fifty patients. J Bone Joint Surg Am. 2006Jun ；88 (6) :1258-65)。INFUSE 骨移植剂和 hductOs 的表达体系都为CHO细胞，表达量低，生产成本很高，并不适合中国发展现状。
在原核表达体系方面，1994年赵明(赵明，王会信，周廷冲.重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性[J].中国生物化学与分子生物学报， 1994，10 (03)319-3 )、1995年陈苏民等(卢兹凡，刘新平，陈苏民，陈南春.人骨形成蛋白 2碳端肽在大肠杆菌中的高表达及活性测定.第四军医大学学报，1995，16 (6) :429-431)完成了 BMP-2的在大肠杆菌中的高效表达，表达产物为包涵体，因此需要进行体外复性。2002 ^tIH Vallejo φ (Gross G, Weich HA, Rinas U. 2002. Renaturation and purification of bone morphogenetic protein-2 producedas inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinantEscherichia coli. J Biotechnol. 2002 Mar 28 ；94 (2) :185-94)在大肠杆菌实现了大规模生产，每升培养液可获得细胞干重75克， 750mg的纯化BMP-2。稀释法进行复性4天后进行肝素柱亲和层析纯化。但是对于BMP-2， 肝素柱载量太小，平均每毫升肝素亲和凝胶不到2mg的结合量。纯化过程需要进行透析更换缓冲液，纯化后还需要超滤浓缩。2004 年，德国 Vallejo 等(Vallejo LF, Rinas U. 2004. Optimizedprocedure for renaturation of recombinant human bone morphogeneticprotein-2 at high protein concentration. Biotechnol Bioeng. 2004 Mar20 ；85 (6) :601-9)成功开发了高浓度的复性方案，可获得高达0. 87mg/mL的活性蛋白，复性率最高达到43%，但所使用的试剂2-环己基乙磺酸(CHES)，尼古丁酸(NA)等都很昂贵，纯化方案仍为肝素柱亲和层析。国内研究者孙奋勇等在2004年进行了复性工艺研究(孙奋勇，汪炬，孙晋华，戴云，邱垂源，洪岸，重组人骨形成蛋白-2在大肠杆菌中的表达、纯化和复性(英文)，中国病理生理杂志，2005，21 (8) 1480-1485) ； 2005年姚少华等利用羟基磷灰石柱层析先纯化包涵体变性蛋白再进行复性(Yao，SH ；Zhang, LL ；Cheng, SY, etal. . 2005. Refolding and Purification of rhBMP-2 Expressed as InclusionBodies in E.coli with Hydroxyapatite Chromatography. KEYENGINEERING MATERIALS. 2005, VOL 288-289 661-664) ；2008年陈苏民进行了高浓度条件下的复性(王馥丽，陈苏民，陈南春，赵玮钦.rhBMP-aii在高浓度条件下的复性.第四军医大学学报，2008，29 (12) 1071-1074)，虽然蛋白浓度高达6mg/mL，但BMP-2变性蛋白需要进行离子交换层析纯化后再变性，透析法复性规模较小，不利于工业化生产。国内外研究者大多采用肝素柱亲和层析进行BMP-2活性蛋白的纯化(Ruppert， R ；Hoffmann, E ；Sebald, W.1996. Human bonemorphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifiesits biological activity. Eur J Biochem. ,1996 Apr 1 ；237(1) :295-302)，并不具备真正意义的工业化规模生产。2006年，徐放(CN 200510050610. 3)开发了离子交换和疏水作用层析法的纯化工艺，纯化方案主要为离子交换为Q Sepharose FF,使用25_100mM的2-环己基乙磺酸 (CHES)，ρΗ7· 5-9. 5，1-3Μ尿素，5-20 %二甲基甲酰胺组成的缓冲液做平衡液，0. 1-1. OM的氯化钠浓度递增的梯度洗脱。采用疏水作用层析则采用苯基琼脂糖凝胶，以25-100mM的 2-环己基乙磺酸，pH7. 5-9. 5，1-3M尿素，5_20 %二甲基甲酰胺，1-4M氯化钠组成的缓冲液做平衡液，进行盐浓度递减的梯度洗脱。该方案仍使用较高浓度的CHES，尿素浓度也较高， 二甲基甲酰胺最高浓度为20%，总体上回收率大于15%，纯度大于95%，但生产成本较高。2007年，刘国安等(CN200610049151. 1)开发了两步离子交换层析法纯化工艺⑴sepharose和CM sepharose)，纯化方案为复性液首先用低盐缓冲液稀释10倍以上进行Q 柱阴离子交换层析，以20mM三羟甲基氨甲烷-HCl、pH8. 5缓冲液做平衡液，进行氯化钠浓度逐步递增的梯度洗脱(目标蛋白在0. 18M梯度)，然后稀释5倍进行CM柱阳离子交换层析， 采用15mM磷酸、pH6. 5平衡液做平衡液，进行氯化钠浓度逐步递增的梯度洗脱(目标蛋白在0. 21M梯度)。但由于复性液浓度仅为0. 08-0. lmg/mL,纯化时首先需要大量的稀释(10 倍)，上样体积很大，不利于规模化生产，再者两步的离子交换层析都没有添加助溶剂，洗脱时BMP-2目标蛋白溶出很慢，甚至不溶解，导致纯化效果变差，不能真正的工业化生产。
发明内容
为了解决现有技术生产重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP1)成熟肽还无法实现高效工业化生产的技术缺陷，本发明提供了一种有别于上述方法的、操作简便、成本低廉、 适合大规模放大的生产高纯度、高活性的重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的分离纯化方法。重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP_2)成熟肽的原核体系构建和表达，包涵体的制备、增溶和复性方法已有文献充分公开，详细可参考徐放(CN01116754.8 ;CN 200510050610. 3)和刘国安等(CN200610049151. 1)，上述文献在此全部引入作为参考。重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP1)成熟肽可以是全长114个氨基酸残基或者N末端加入甲硫氨酸的115氨基酸残基；也可以是截短型的成熟肽，一个例子为108个氨基酸残基的截短型成熟肽(文献参考 CNOl 116754. 8)，具体序列为MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHA FYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR包涵体经过复性以后，上述的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP_2)成熟肽单体以二聚体形式存在，其中单体各形成3对二硫键，在两个单体之间形成一对链间二硫键。本发明提供了一种重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMPD成熟肽的分离纯化方法， 该方法包括以下步骤(1)将复性好的重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽溶液上样于经平衡好的疏水层析柱，上样完毕后继续用平衡缓冲液冲洗到达基线，所述的平衡缓冲液包含10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N-二甲基甲酰胺、1-3M氯化钠或者硫酸铵，pH为 7. 0-9. 0 ；(2)用洗脱缓冲液进行盐浓度逐步降低的阶梯梯度洗脱，收集目标峰，所述的洗脱缓冲液包含10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N, N-二甲基甲酰胺，pH为 7. 0-9. O0上述方法中，疏水层析柱介质可自苯基琼脂糖凝胶(包括但不限于Wienyl Sepharose 6 Fast Flow(low sub), Phenyl Sepharose 6Fast Flow(high sub), Phenyl Sepharose High Performance)，丁基琼脂糖凝胶(包括但不限于 Butyl Sepharose 4Fast Flow, Butyl-SSepharose 6 Fast Flow, Butyl Sepharose High Performance),辛基琼月旨糖凝胶(包括但不限于Octyl Sepharose 4 Fast Flow)，乙基聚合树脂(SOURCE ΕΤΗ)，异丙基聚合树脂(SOURCE 15IS0)，苯基聚合树脂(SOURCE 15PHE)。上述方法中，平衡缓冲液和洗脱缓冲液可进一步含有10_50mM三羟甲基氨甲烷-HC1，以更好的维持缓冲液体系pH为7. 0-9. 0。
为进一步提高目标峰的蛋白纯度，纯化方法可以是多步疏水作用层析或者与离子交换层析联合使用。作为优选方案之一，纯化方法可以是多步疏水作用层析。一步疏水层析得到的目标峰再经1-2次疏水层析，可有效提高蛋白纯度至97%以上。作为优选方案之一，纯化方法可为疏水层析和阴离子交换层析联用，层析介质为Q 琼脂糖凝胶快速流Ο -s印harose Fast Flow)、Q琼脂糖凝胶高分辨率^hs印harose HP)或者Q聚合树脂(SOURCE 15Q, SOURCE 30Q)，平衡缓冲液包含10_50mM三羟甲基氨甲烷-HC1、 10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和2-10% N，N-二甲基甲酰胺，pH为8. 0-9. 0 ；洗脱液为添加了 1-3M NaCl的平衡缓冲液。该方法除上述疏水层析步骤外，进一步包含以下步骤(1)将疏水层析得到的目标峰经平衡缓冲液稀释后，上样于经平衡好的阴离子交换层析柱，上样完毕后继续用平衡缓冲液冲洗到达基线，所述的平衡缓冲液包含10_50mM 三羟甲基氨甲烷-HCl、10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和2-10% N，N-二甲基甲酰胺，PH 为 8. 0-9. 0 ；(2)用洗脱缓冲液进行盐浓度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰，所述的洗脱缓冲液包含10-50mM三羟甲基氨甲烷-HCl、10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和 2-10% N, N- 二甲基甲酰胺、1-3M NaCl, pH 为 8. 0-9. 0。作为优选方案之一，纯化方法可为疏水层析和阳离子交换层析联用，层析介质为羧甲基琼脂糖凝胶快速流(CM-kpharose Fast Flow)，平衡缓冲液包含10_50mM磷酸二氢钠-HCl、10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N, N-二甲基甲酰胺，pH为 6.0-6.5。洗脱液为添加了 1-3M NaCl的平衡缓冲液。该方法除上述疏水层析步骤外，进一步包含以下步骤(1)将疏水层析得到的目标峰经平衡缓冲液稀释后，上样于经平衡好的阳离子交换层析柱，上样完毕后继续用平衡缓冲液冲洗到达基线，所述的平衡缓冲液包含10_50mM 磷酸二氢钠-HCl、10-30mM2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N_ 二甲基甲酰胺，pH 为 6. 0-6. 5 ；(2)用洗脱缓冲液进行盐浓度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰，所述的洗脱缓冲液包含10-50mM磷酸二氢钠-HCl、10-30mM2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N， N-二甲基甲酰胺、l_3MNaCl，pH 为 6. 0-6. 5。本发明由于采用了上述的方案，成功实现了重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的工业化大规模生产。本发明通过多次试验摸索，发现采用高浓度的尿素和DMF做助溶剂，将增大重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的极性，在疏水层析过程中将降低与疏水介质的结合度，从而降低蛋白纯化的效率和分离度。本发明通过系统研究，意外发现通过调整纯化缓冲液的组成，即使用较低浓度的尿素和DMF做助溶剂，并减少了 CHES的用量，可有效提高蛋白纯化的效率和分离度，目标蛋白的纯度也更高。而且由于降低了尿素、DMF和CHES的用量，生产成本可降低50%以上。本纯化方法与徐放的发明(CN200510050610.3)相比，具有操作更简便、成本更低廉、纯化收率更高(大于20% )、纯度更高(SDS-PAGE、HPLC及HPCE 均大于97% )等优点。该法适用于重组人骨形态发生蛋白家族的工业化纯化生产。
图1疏水作用层析纯化BMP-2层析图。其中1为UW80nm，2为UW60nm，3为溶液电导，4为洗脱梯度。峰1为洗脱梯度1，峰2为洗脱梯度2，峰1和峰2含有较多的目标蛋白，峰3为洗脱梯度3，含有较少的目标蛋白，峰4为清洗峰，主要为杂蛋白和单体蛋白，多聚体等。图2典型的rhBMP-2电泳图(银染)。图示Lanel 复性液，lane2 峰1和峰2合并，lane3 峰 1，lane4 峰 2，lane5 峰 3，lane6 峰 4，lane7 蛋白质分子量 marker (从上下分别为 97. 4、，66. 1、43、，31、20、14. 4KDa)。图3典型的rhBMP-2电泳图(银染)。图示Lanel 复性液，lane2 一步疏水柱洗脱峰1，lane3 —步疏水柱洗脱峰峰2，lane4 两步疏水洗脱主峰，lane5 一步疏水、一步阴离子交换后主峰，lane6 —步疏水、一步阳离子交换后主峰，lane7 蛋白质分子量marker (从上下分别为97. 4,66. 1、43、31、20、14. 4KDa)，lane 8 两步疏水洗脱峰浓缩样品。图4rhBMP-2的毛细管电泳纯度分析，UV214nm检测。采用面积归一法计算纯度为
97.4%。图5rhBMP-2的毛细管电泳纯度分析，UV214nm检测。采用面积归一法计算纯度为
98.0%。图6rhBMP-2的毛细管电泳纯度分析，UV214nm检测。采用面积归一法计算纯度为 98. 5%。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行进一步说明，实施例中涉及的是截短型108个氨基酸残基的BMP-2成熟肽。本领域的技术人员可以理解，由于其与全长的BMP-2成熟肽性质相似，因而也适合于全长型的BMP-2成熟肽的分离纯化。实例1包涵体的增溶以1克包涵体20mL裂解液的比例将包涵体溶解到裂解液中(7M盐酸胍，50mM Tris-HCl，pH8. 0，ImM EDTA, IOmM DTT)在室温下搅拌2小时以上或者4°C搅拌过夜。然后在12000rpm、4°C下离心20min，弃沉淀取离心上清液。采用Bradford法测定蛋白浓度。或用以下方法增溶。以1克包涵体20mL裂解液的比例将包涵体溶解到裂解液中 (8M 尿素，50mM Tris-HCl, pH8. 5, ImM EDTA, IOmM DTT)在室温下搅拌 2 小时以上或者 4°C 搅拌过夜。然后在12000rpm、4°C下离心20min，弃沉淀取离心上清液。采用Bradford法测定蛋白浓度。实例2包涵体的复性采用稀释法复性。复性液组成为100mMTris-HCl，0. 5M L-Arg,0. 5M Urea, IM NaCl，2mM EDTA，pH8. 5-9. 5，ImM氧化性谷胱甘肽，5mM还原型谷胱甘肽。将包涵体增溶液缓慢加入到复性液中，控制蛋白终浓度为0. 05-0. :3mg/mL，在4-20度恒温环境下复性1_20天。实例3复性液的疏水作用层析首先采用盐浓度低的疏水作用层析，层析填料为phenyls印harose Fast Flow，平衡液为 phe-A:0. 5M urea,25mM CHES, 15mMTris, pH8. 5,5% N, N-二甲基甲酰胺，IM NaCl。 洗脱液为 phe-B :0. 5Murea，25mM CHES, 15mM Tris，pH8. 5，5% N，N_ 二甲基甲酰胺。首先用平衡液Phe-A平衡，复性液直接上样，上样完毕后继续用平衡缓冲液phe-A冲洗到紫外到达基线，然后用洗脱缓冲液Phe-B进行盐浓度逐步降低的梯度进行洗脱，收集主峰。为进一步提高纯度，可对收集主峰继续采用盐浓度高的疏水作用层析。层析填料为 phenyl sepharose Fast Flow，平衡液为 phe_3A :0. 5Murea，25mM CHES, 15mM Tris, pH8. 5，4% N，N-二甲基甲酰胺，3MNaCl。洗脱液为 phe_3B :0. 5M urea,25mM CHES, 15mM Tris, pH8. 5,4% N, N- 二甲基甲酰胺。首先用平衡液phe_3A平衡，上述盐浓度低的疏水作用层析洗脱样品补加NaCl到3M后上样，上样完毕后继续用平衡缓冲液phe-3A冲洗到紫外到达基线，然后用洗脱缓冲液Phe-IBB进行盐浓度逐步降低的阶梯梯度进行洗脱(35%， 65%，85% B)，分步收集相应主峰。SDS-PAGE电泳银染分析样品纯度。典型的层析图如图 1所示，电泳图如图1和图2所示。从复性液投料算起，复性率大于50%，最终目标蛋白的收率为21%，用毛细管电泳分析纯度，纯度为97. 4% (图4)。实例4疏水作用层析与阴离子交换层析联用纯化首先采用疏水作用层析，层析填料为phenyl sepharose Fast Flow，平衡液为 phe-3A :0. 8M urea, 15mM CHES, 15mM Tris，pH8. 5，4% N，N-二甲基甲酰胺，3M NaCl。洗脱液为 phe-3B :0. 8M urea, 15mM CHES, 15mM Tris，pH8. 5，4% N，N-二甲基甲酰胺。首先用平衡液phe_3A平衡，复性液直接上样，上样完毕后继续用平衡缓冲液phe-3A冲洗到紫外到达基线，然后用洗脱缓冲液Phe-IBB进行盐浓度逐步降低的阶梯梯度进行洗脱(35%，65%， 85% B)，分步收集相应主峰。接着进行阴离子交换层析，Q-kpharose Fast Flow，平衡液为Q-A :0. 8M urea, 15mM CHES, 15mM Tris, pH8. 5,4% N, N-二甲基甲酰胺。洗脱液为 Q-B :0. 8M urea, 15mM CHES, 15mM Tris, ρΗ8· 5,4% N，N- 二甲基甲酰胺，IMNaCl0首先用平衡液Q-A平衡好柱子， rhBMP-2样品用平衡液Q-A稀释10倍以上使电导率低于6mS/cm，然后上样，上样完毕后继续用平衡缓冲液Q-A冲洗到紫外到达基线，然后用洗脱缓冲液Q-B进行盐浓度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰。SDS-PAGE电泳银染分析(图幻和毛细管电泳分析样品纯度为 98. 0% (图 5)。实例5疏水作用层析与阳离子交换层析联用纯化首先采用疏水作用层析，层析填料为phenyl sepharose Fast Flow，平衡液为 phe-3A :0. 5M urea,25mM CHES, 15mM Tris，pH8. 5，2% N，N-二甲基甲酰胺，3M NaCl。洗脱液为 phe-3B :0. 5M urea,25mM CHES, 15mM Tris, pH8. 5,2% N, N-二甲基甲酰胺。首先用平衡液phe_3A平衡，复性液直接上样，上样完毕后继续用平衡缓冲液phe-3A冲洗到紫外到达基线，然后用洗脱缓冲液Phe-IBB进行盐浓度逐步降低的阶梯梯度进行洗脱(35%，65%， 85% B)，分步收集相应主峰。接着进行阳离子交换层析纯化，层析填料为CM-kpharose FastFlow，平衡液为 CM-A 0. 5M urea,25mM CHES, 15mM NaAc-HAc,2% N, N- 二甲基甲酰胺，ρΗ6· 5。洗脱液为 CM-B 0. 5M urea,25mMCHES, 15mM NaAc-MAc,2% N, N- 二甲基甲酰胺，IM NaCl, ρΗ6· 5。先用平衡液CM-A平衡好柱子，疏水层析洗脱样品用平衡液CM-A稀释5倍以上是电导率低于 6ms/cm,然后上样，上样完毕后继续用平衡缓冲液CM-A冲洗到紫外到达基线，然后用洗脱缓冲液CM-B进行盐浓度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰。SDS-PAGE电泳银染分析(图 3)和毛细管电泳分析样品纯度为98. 5% (图6)。
权利要求
1.一种重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的纯化生产方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将复性好的重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽溶液上样于经平衡好的疏水层析柱，上样完毕后继续用平衡缓冲液冲洗到达基线，所述的平衡缓冲液包含10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N-二甲基甲酰胺、1-3M氯化钠或者硫酸铵，pH为 7. 0-9. 0 ；(2)用洗脱缓冲液进行盐浓度逐步降低的阶梯梯度洗脱，收集目标峰，所述的洗脱缓冲液包含10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2_10 % N，N-二甲基甲酰胺，pH为 7. 0-9. O0
2.根据权利要求1所述的纯化生产方法，其特征在于，所述的疏水层析柱介质选自苯基琼脂糖凝胶，丁基琼脂糖凝胶，辛基琼脂糖凝胶，乙基聚合树脂，异丙基聚合树脂或苯基聚合树脂。
3.根据权利要求1所述的纯化生产方法，其特征在于，所述的平衡缓冲液和洗脱缓冲液中含有10-50mM三羟甲基氨甲烷-HCl。
4.根据权利要求1所述的纯化生产方法，其特征在于，所述的纯化方法是多步疏水作用层析，一步疏水层析得到的目标峰再经1-2次疏水层析，收集目标峰。
5.根据权利要求1所述的纯化生产方法，其特征在于，所述的纯化方法为疏水作用层析和离子交换层析联合使用。
6.根据权利要求5所述的纯化生产方法，其特征在于，所述的离子交换层析为阴离子交换层析联用，层析介质为Q琼脂糖凝胶快速流(Q-sepharose Fast Flow)、Q琼脂糖凝胶高分辨率 to-s印haroseHP)或者 Q 聚合树脂(SOURCE 15Q, SOURCE 30Q)。
7.根据权利要求6所述的纯化生产方法，其特征在于，所述方法除疏水层析步骤外，还包含以下步骤(1)将疏水层析得到的目标峰经平衡缓冲液稀释后，上样于经平衡好的阴离子交换层析柱，上样完毕后继续用平衡缓冲液冲洗到达基线，所述的平衡缓冲液包含10-50mM三羟甲基氨甲烷-HCl、10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和2_10% N, N- 二甲基甲酰胺， pH 为 8. 0-9. 0 ；(2)用洗脱缓冲液进行盐浓度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰，所述的洗脱缓冲液包含10-50mM三羟甲基氨甲烷-HCl、10-30mM2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和2-10% N， N- 二甲基甲酰胺、l_3MNaCl，pH 为 8. 0-9. 0。
8.根据权利要求5所述的纯化生产方法，其特征在于，所述的离子交换层析为阳离子交换层析联用，层析介质为羧甲基琼脂糖凝胶快速流(CM-kpharose Fast Flow)。
9.根据权利要求8所述的纯化生产方法，其特征在于，所述方法除疏水层析步骤外，还包含以下步骤(1)将疏水层析得到的目标峰经平衡缓冲液稀释后，上样于经平衡好的阳离子交换层析柱，上样完毕后继续用平衡缓冲液冲洗到达基线，所述的平衡缓冲液包含10-50mM磷酸二氢钠-HCl、10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N_ 二甲基甲酰胺，pH为 6. 0-6. 5 ；(2)用洗脱缓冲液进行盐浓度逐步增加的梯度进行洗脱，收集主峰，所述的洗脱缓冲液包含10-50mM磷酸二氢钠-HCl、10-30mM 2-环己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N_ 二甲基甲酰胺、1-3M NaCl，pH 为 6. 0-6.5。
全文摘要
一种重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的生产方法本发明涉及一种重组人形态发生蛋白2成熟肽的生产方法。该方法通过将复性好的重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽溶液上样于经平衡好的疏水层析柱，然后用洗脱缓冲液进行盐浓度逐步降低的阶梯梯度洗脱，收集目标峰。为进一步提高目标峰的蛋白纯度，纯化方法可以是多步疏水作用层析或者与离子交换层析联合使用。该方法具有操作更简便、成本更低廉、纯化收率更高(大于20％)、纯度更高(SDS-PAGE、HPLC及HPCE均大于97％)等优点，适合用于重组人骨形态发生蛋白家族的生产。
文档编号C07K1/18GK102336829SQ20101028484
公开日2012年2月1日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者朱晴羽, 王同映, 郭旺明 申请人:杭州九源基因工程有限公司