专利名称：一种缓释重组人骨形态发生蛋白-2聚l乳酸微球及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种药物载体及其制备，尤其涉及一种缓释重组人骨形态发生蛋白-2聚L乳酸微球及其制备方法。
背景技术：
外源性生长因子的开发和应用研究一直是再生医学、肿瘤生物治疗等领域最活 跃的课题之一。活性生长因子在体内的半衰期短，全身或局部应用很快被稀释代谢，直接 应用不能满足组织修复再生及治疗的需要。利用合适的载体材料携带生长因子植入体内 时，可持续保持其生物活性并延长作用时间，正受到日益广泛的重视和关注。随着基因工 程和生物技术的发展，越来越多的多肽类药物用于治疗和预防疾病。骨形成蛋白是转化生 长因子β (TGF-β)超家族中的一组多功能细胞因子，是已知效应最强的骨生长因子，具有 诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化，最终促使软骨、骨形成的作用。但重组人骨形态发生蛋 白-2(rhBMP-2)和其他细胞生长因子一样，容易被酶降解，在局部和全身应用的生物利用 度低。将BMP与某种可作为其载体的材料复合后植入体内，可使BMP作用更持久，能生成 更多新骨。研究开发新的BMP载体是骨组织工程的一个热点。所谓载体及缓释系统，是指 骨形态发生蛋白(BMP)与之结合后植入体内时，可使BMP继续保持其成骨活性，并因作用时 间更持久而使新骨生长量较单纯应用BMP为多。这时载体及缓释系统起到了三种作用1) 载负BMP，使之与周围组织均勻接触，利于诱导周围间充质细胞分化为骨系细胞，形成新骨； 2)可作为骨生长支架促进骨生长；3)可控制地缓慢释放BMP，使之作用时间更持久。因此， 制备具有缓释特性的BMP-2给药剂型是当今药物开发的趋势。另外，多种骨生长因子在体内促进成骨作用的发挥，都有赖于与适宜的载体缓释 系统结合，否则骨生长因子(如纯化bBMP)极易被体液稀释转运吸收，或被迅速降解。对固 体性载体(如同种或异种骨，高分子多聚体，经基磷灰石等)的研究较多，对可溶性载体的 研究很少。而可溶性载体对骨生长因子的实验研究及临床应用都有重要作用，特别是某些 水溶性较差的骨生长因子以混悬注射液方式给药或进行体外研究时，适宜的载体更是必不 可少的。除了对载体的一般要求外，如缓释作用，不引起炎症和排斥反应，易吸收等，还要求 这类载体有良好水溶性及助溶助悬作用，不降低骨生长因子活性。用于包封rhBMP-2的载 体材料可分为天然、半合成和合成的高分子材料。如明胶水凝胶，甲基纤维素等。这些材料 包裹rhBMP-2尚存在诸多问题，如材料的生物安全性，缓释期太短，难以保存rhBMP-2的生 理活性等，因此其局部或全身应用的生物利用度低。另外，传统工艺工序复杂、周期长、有机 溶剂难于去除、颗粒大且分布范围宽，通常将生长因子复合进聚合物的方法和过程存在的 主要问题是这些方法和过程可能使得蛋白活性的丧失。通常的高温、超声、有机溶剂都有可 能使得蛋白失活变性。因此，为了最大化保持蛋白活性，用一种温和工艺条件方法来制备载 蛋白聚合物载体是必要的。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明目的之一在于提供一种生物安全性高，突释期小，缓释期长，更易保存rhBMP-2生理活性的缓释重组人骨形态发生蛋白_2聚L乳酸 微球(rhBMP-PLLA)；本发明另一目的在于提供上述微球的制备方法，其不损伤蛋白活性、 工序简单、周期短、有机溶剂易去除，且所得微球颗粒具有前述优点。本发明的技术方案是一种缓释重组人骨形态发生蛋白_2聚L乳酸微球，微 球基质成分为聚L乳酸，包裹的药物为重组人骨形态发生蛋白-2，聚L乳酸和重组人 骨形态发生蛋白_2的混合有机溶液经超临界流体二氧化碳萃取溶剂后析出所述微球 结晶，该微球的粒径范围在825nm 1280nm，包封率和载药量分别为(98. 7士 1.2) %和 [(24. 0士0. 1) X 10_3] %，体外释药平均浓度为(3. 1 士0.54) μ g/mL，突释期内为4. 97 % 士 1. 8 %，26天后释放度达92. 99 士 7. 01 %，所释放出的重组人骨形态发生蛋白_2活性蛋白 结构完整，而且是同源二聚体形式存在。一种缓释重组人骨形态发生蛋白_2聚L乳酸微球的制备方法，包括以下步骤1)将浓度为10mg/ml的重组人骨形态发生蛋白_2有机溶液和浓度为8. 16mg/ml 的聚L乳酸有机溶液混合得到混合溶液，其溶质含量比值为1 40;2)将冷却液化的二氧化碳经加压升温后，通过同轴二流式喷嘴外侧通道，泵入高 压釜中，其流速为300ml/min，并维持高压釜内压力、温度恒定，其压力、温度分别为12MPa、 33 °C ；3)将混合溶液由高效液相色谱泵通过同轴二流式喷嘴内侧通道泵入高压釜，其流 速为0. 5ml/min，使得溶质从溶液中以微球形式结晶析出，得到重组人骨形态发生蛋白-2 聚L乳酸微球；4)得到微球后，停止泵入混合溶液，维持高压釜压力及温度不变，继续通入二氧化 碳淋洗微球结晶去除有机溶剂残留。作为优选，所述重组人骨形态发生蛋白-2有机溶液的溶剂为二甲亚砜，所述聚L 乳酸有机溶液的溶剂为二氯甲烷。本发明的有益效果是本方法相对于传统方法更加洁净、绿色环保、制备条件温 和，因为整个过程中有机溶剂残留很少，不使用高温和机械剪切力。所制备的缓释微球通 过测定，rhBMP-PLLA微球表面光滑，粒径为825nm 1280nm，粒径分布范围较窄，完全达到 文献报道微球粒径所要求的标准。本申请制备的rhBMP-2-PLLA微球体外释药试验检测表 明突释期仅为4. 97%，26d后释放度达92. 99士7. 01 %，符合纳米微球的一般规律。微球 在26d内不仅一直持续释放rhBMP-2，而且所释放出的rhBMP-2，平均浓度为(3. 1 士0. 54) μ g/mL,采用Western blot技术检测rhBMP-2微球样品显示所释放出的rhBMP-2活性蛋 白结构完整，而且是同源二聚体形式存在，制备过程并没有破坏蛋白结构的完整性，可满足 rhBMP-PLLA微球发挥促骨形成的生物活性的需要。目前认为缓释微球中药物的释药机制一 般认为有三种(1)扩散；(2)囊膜或材料的溶蚀；(3)囊膜及材料的降解。在释放初期阶段 药物主要是在浓度梯度作用下释放，随着聚乳酸的降解和融蚀，药物在浓度梯度作用下从 孔道扩散到组织，随着聚乳酸完全降解，微球体系崩解，药物完全释放出来，以维持药物的 持续作用浓度供组织修复利用。PLLA在体内以水解方式降解后，乳酸参加三羟酸循环，乙 醇酸经尿排出体外，多聚体降解后可被机体完全吸收。实验证明，BMPs是以悬浮方式结合在条片状多聚体之上的。本申请表明rhBMP-2-PLA纳米微球在体外26d后仍能释放有生物 活性的rhBMP-2，因而可以在以后临床研究中采用PLLA作为该类蛋白质缓释制剂的载体材 料。同时，实验结果显示微球模拟体外释药的26d时间内，不仅一直持续释放rhBMP-2，而且 所释放出的rhBMP-2浓度可以保持在一定的水平，因而有望使其在10 14d的骨创伤初期 修复阶段以及1个月时间的骨重建阶段，持续在组织局部释放rhBMP-2，并维持在有效生理 浓度以上，以显著促进骨创伤组织修复。
图1为本发明方法的装置示意图；图2为本发明实施例1的微球的5000倍SEM图；图3为本发明实施例1的微球的10000倍SEM图；图4为本发明实施例1的微球的粒径分布；图5为本发明实施例1的微球的rhBMP的体外释放特性曲线；图6为本发明实施例1的微球释放的蛋白印迹检测结果；
具体实施例方式作为本发明的一种实施方式，一种缓释重组人骨形态发生蛋白_2聚L乳酸微 球，微球基质成分为聚L乳酸，包裹的药物为重组人骨形态发生蛋白-2，聚L乳酸和重组 人骨形态发生蛋白_2的混合有机溶液经超临界流体二氧化碳萃取溶剂后析出所述微球 结晶，该微球的粒径范围在825nm 1280nm，包封率和载药量分别为(98. 7士 1.2)%和 [(24. 0士0. 1) X 10_3] %，体外释药平均浓度为(3. 1 士0.54) μ g/mL，突释期内为4. 97 % 士 1. 8 %，26天后释放度达92. 99 士 7. 01 %，所释放出的重组人骨形态发生蛋白_2活性蛋白 结构完整，而且是同源二聚体形式存在。一种缓释重组人骨形态发生蛋白_2聚L乳酸微球的制备方法，包括以下步骤1)将浓度为10mg/ml的重组人骨形态发生蛋白_2有机溶液和浓度为8. 16mg/ml 的聚L乳酸有机溶液混合得到混合溶液，其溶质含量比值为1 40;作为优选，所述重组人 骨形态发生蛋白_2有机溶液的溶剂为二甲亚砜，所述聚L乳酸有机溶液的溶剂为二氯甲 烷；2)将冷却液化的二氧化碳经加压升温后，通过同轴二流式喷嘴外侧通道，泵入高 压釜中，其流速为300ml/min，并维持高压釜内压力、温度恒定，其压力、温度分别为12MPa、 33 °C ；3)将混合溶液由高效液相色谱泵通过同轴二流式喷嘴内侧通道泵入高压釜，其流 速为0. 5ml/min，使得溶质从溶液中以微球形式结晶析出，得到重组人骨形态发生蛋白-2 聚L乳酸微球；4)得到微球后，停止泵入混合溶液，维持高压釜压力及温度不变，继续通入二氧化 碳淋洗微球结晶去除有机溶剂残留。实施例1(如图1所示)1)来自于钢瓶中的CO2经制冷系统液化后，由高压柱塞泵加压，再由管路中的恒温 水浴升温后，通过高压釜顶部同轴二流式喷嘴外侧通道，被泵入体积为500ml的高压釜中。待釜内达到要求的压力，维持CO2泵入速率300ml/min，开启放气阀以一定速率放气，维持釜内压力恒定为12MPa。调节高压釜外部干燥箱及管路水浴温度，以保持釜内温度恒定为 33°C。当达到实验所需温度33°C后，12mg重组人骨形态发生蛋白-2 (recombinant human BMP-2, rhBMP-2)溶于1. 2ml的二甲亚砜，480mg聚L乳酸(PLLA)溶于58. 8ml的二氯甲烷 (DCM)中，当两种溶液都完全溶解后，将两者完全混合得到混合溶液。混合溶液由高效液相 色谱(HPLC)泵通过喷嘴内侧通道以流速为0. 5ml/min泵入高压釜。当混合溶液一接触到超 临界流体二氧化碳(SCCO2)，溶剂被SCCO2萃取，使得试验溶液变成溶质的过饱和溶液，溶质 从溶液中以微球形式结晶析出。结束泵样后，维持压力及温度不变，继续通入CO2淋洗30min 以去除有机溶剂残留。结束清洗后，缓慢卸压，待釜内压力降为常压时，打开沉积釜收集样
品 O主要试剂聚L乳酸(PLLA，IOOKDa) 化学纯 山东省医疗器械研究所重组人骨形态发生蛋白_2珠海安进生物技术有限(recombinant human BMP—2，注射级公司rhBMP-2) *成都长联化工试剂有限二氯甲烷分析纯公司乙醇分析纯 成都市科龙化工试剂厂二甲亚砜分析纯 成都市科龙化工试剂厂二氧化碳(含量≥ 99.9% ) 医用级 成都拓展气有限公司Antibody sampler kitCell Signaling 公司(rabbit polyclonal IgG)PVDF 膜PMillipore 公司蛋白质分子量MarkerFermentas公司过硫酸铵GIBCO BRL公司女注rhBMP-2的一般理化特性酸性蛋白，可耐受55_75°C，对胰蛋白酶敏感，酸 性条件下稳定，PH > 8. 5则失活，溶于中性盐溶液(pH7. 2)，溶于6M尿素或4M盐酸胍和 0.1%醋酸。不溶于氯仿/甲醇、纯酒精和丙酮。利用基因工程技术在大肠杆菌系统中重组 表达BMP-2，经分离、纯化、复性后得到高纯度和活性的rhBMP-2。分子量单体约12110Da， 同二聚体约24. 24kDa，等电点约6. 56。N-端氨基酸序列BMP_2总共有115个氨基酸组 成，前五个氨基酸序列为Met-Gln-Ala-LyS-HiS。产品形式冻干粉(冷冻干燥)；比活 lOOOUnits/mg，活性单位定义为rhBMP-2植入小鼠股部肌间隙14天时，植入区钙生成1 μ g 为一个生物活性单位。纯度①RP-HPLC分析≥ 95% ；②SEC-HPLC分析≥ 95% ；③reducing and non-reducing SDS-PAGE分析≥ 95%。保存条件冻干粉在_2(TC下可长期保存。液 体状态在4°C下可保存数周，在-20-7(TC下长期保存。主要仪器
电子分析天平上海上平仪器公司85-IC磁力搅拌器上海闵行虹浦仪器厂JSM-5900LV型扫描电镜日本电子公司RS-2008激光粒度仪山东济南润之公司
傅立叶红外光谱仪NEXUS670 美国尼高力公司耐弛差示量热扫描仪STA449C 德国NetzchX射线衍射仪X，Pert MDP 荷兰飞利浦浙江省杭州市石化器械有限2J-X8/32 高压泵公司DHG-9070A加热干燥烘箱上海景洪实验仪器有限公司HPLC 泵德国 Knauer 公司超细微球装置江苏南通石油公司荧光光谱仪F-7000日立科技紫外分光光谱仪F-3010日立科技倒置荧光显微镜1X71日本奥林巴斯微球表面形貌(如图2、3所示)PLLA和rhBMP_2_PLLA载药微球的形貌在扫描电 镜上观测。样品采用无水乙醇分散，分散悬浮液滴在载物台后真空干燥后进行电镜观测。粒径及粒径分布(如图4所示)微球的粒径和粒度分布通过激光粒度仪检测。粒 径分布采用跨度(Span)表征=Span = (D90-D10)/D50.在这里，Dltl，D5tl和D9tl，代表累积体积在 10%，50%和90%时的直径大小。载药量和包封率rhBMP-2含量的测定采用BCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓 度定量试剂盒。载药量二 ^ χ 100%;包封率二 ^ X 100% W1为微球内的药量;w2为
微球的总量;w3为微球内药量及介质中的药量。体外药物释放研究(如图5所示)30mg rhBMP-2-PLLA微球被放入茶包袋，然后 悬挂在装有IOml释放介质的离心管中，并放在37°C的恒温摇床里。在这个研究中，释放介 质为磷酸缓冲液(PBS，pH = 6. 8)。在预定的释放时间，IOml的释放液被取出来，所取溶液 使用上述rhBMP-2含量测试方法测试浓度。用标准曲线求出药物浓度并换算成不同时间的 累积溶出百分率，绘制时间_累积释放率的释药曲线图。以累计释放量和时间拟合方程，作 出缓释rhBMP-2微球体外释药曲线图。释药数据用三种常用数学模型拟合，即零级方程、一 级方程及Higuchi方程拟合，拟合时以相关系数(r)最大而均方误差(MSE)最小的为拟合 结果最好。BMP-2蛋白的完整性和时相性(如图6所示)体外释放BMP-2蛋白的完整性和时 相性通过Western blot方法测定；本实施例制备的rhBMP-PLLA缓释微球，微球表面光滑，有一定的黏连，包封率和 载药量分别为(98. 7 士 1. 2) %和[(24. 0 士0. 1) X IO"3] %，粒径为825nm 1280nm，粒径分 布范围较窄，完全达到文献报道微球粒径所要求的标准。体外释药试验检测表明突释期释 放仅为4. 97%,26d后释放度达92. 99士7. 01 %，符合纳米微球的一般规律。微球在26d内不仅一直持续释放rhBMP-2，而且所释放出的rhBMP-2平均浓度为(3. 1 士0.54) μ g/mL ；采 用Western blot技术检测rhBMP-2微球样品显示所释放出的rhBMP-2活性蛋白结构完整， 而且是同源二聚体形式存在，可满足rhBMP-PLLA微球发挥促骨形成的生物活性的需要。
权利要求
一种缓释重组人骨形态发生蛋白-2聚L乳酸微球，其特征在于微球基质成分为聚L乳酸，包裹的药物为重组人骨形态发生蛋白-2，聚L乳酸和重组人骨形态发生蛋白-2的混合有机溶液经超临界流体二氧化碳萃取溶剂后析出所述微球结晶，该微球的粒径范围在825nm～1280nm，包封率和载药量分别为(98.7±1.2)％和[(24.0±0.1)×10-3]％，体外释药平均浓度为(3.1±0.54)μg/mL，突释期内为4.97％±1.8％，26天后释放度达92.99±7.01％，所释放出的重组人骨形态发生蛋白-2活性蛋白结构完整，而且是同源二聚体形式存在。
2.—种权利要求1所述的缓释重组人骨形态发生蛋白_2聚L乳酸微球的制备方法，其 特征在于包括以下步骤1)将浓度为10mg/ml的重组人骨形态发生蛋白_2有机溶液和浓度为8.16mg/ml的聚 L乳酸有机溶液混合得到混合溶液，其溶质含量比值为1 40;2)将冷却液化的二氧化碳经加压升温后，通过同轴二流式喷嘴外侧通道，泵入高压 釜中，其流速为300ml/min，并维持高压釜内压力、温度恒定，其压力、温度分别为12MPa、 33 °C ；3)将混合溶液由高效液相色谱泵通过同轴二流式喷嘴内侧通道泵入高压釜，其流速为 0. 5ml/min,使得溶质从溶液中以微球形式结晶析出，得到重组人骨形态发生蛋白_2聚L乳 酸微球；4)得到微球后，停止泵入混合溶液，维持高压釜压力及温度不变，继续通入二氧化碳淋 洗微球结晶去除有机溶剂残留。
3.根据权利要求2所述的缓释重组人骨形态发生蛋白_2聚L乳酸微球的制备方法，其 特征在于所述重组人骨形态发生蛋白_2有机溶液的溶剂为二甲亚砜，所述聚L乳酸有机 溶液的溶剂为二氯甲烷。
全文摘要
本发明公开了一种缓释重组人骨形态发生蛋白-2聚L乳酸微球及其制备方法，涉及一种药物载体及其制备，微球基质成分为PLLA，包裹的药物为rhBMP-2，所释放出的rhBMP-2活性蛋白结构完整，而且是同源二聚体形式存在；制备方法包括步骤rhBMP-2有机溶液和PLLA有机溶液混合得到混合溶液；混合有机溶液经超临界流体CO2萃取溶剂后析出所述微球结晶；得到微球后，停止泵入混合溶液，维持高压釜压力及温度不变，继续通入CO2淋洗微球结晶去除有机溶剂残留。本发明方法工序简单、周期短、有机溶剂易去除，且所得微球颗粒生物安全性高，突释期小，缓释期长，更易保存rhBMP-2生理活性。
文档编号A61K9/16GK101822645SQ20101016003
公开日2010年9月8日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者何学令, 吴江, 尹光福, 康云清, 郭应强, 陈槐卿 申请人:吴江