专利名称：一种重组人骨形成蛋白－2的表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说涉及一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法。
背景技术：
人骨形成蛋白-2(human bone morphorgenetic protein-2，hBMP-2)是骨形成蛋白家族一员，属于TGF-β超家族，有活性成熟的hBMP-2是由两个114个氨基酸残基构成的同源二聚体。hBMP-2在人体的生理功能广泛，在调节细胞的生长、分化、趋化作用及凋亡等方面均发挥着重要的作用，结合人体相容性组织工程材料可促进大面积骨损伤愈合，并可大量应用于牙齿修复、美容整形，因而在临床上具有广泛的应用前景。
国外以动物细胞表达系统为主生产rhBMP-2，成本高，产量低，活性好，可正常糖基化。美国FDA已批准上市，用于脊椎融合。国内华东基因研究所用大肠杆菌表达rhBMP-2，其是在包涵体阶段先复性后纯化，这样复性效率较低，活性不好。
发明内容
本发明的目的是克服现有人骨形成蛋白-2生产方法存在的问题，提供一种成本低、复性效率高、活性好的人骨形成蛋白-2的表达方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法，包括如下步骤(1)目的基因hBMP-2的合成；(2)双酶切hBMP-2基因与载体，连接构建重组载体，转化宿主菌，构建hBMP-2基因工程菌；(3)培养hBMP-2基因工程菌，分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液；(4)纯化包涵体；(5)复性；(6)超滤、透析、冻干得到重组人骨形成蛋白-2。
上述步骤(1)所述目的基因的合成为设计上游引物ATCGCATATGGGCCTAACCTTCTTTTGAAGCTTATTCAA，下游引物ACGTGGATCCCTATTAGCAACACCCACAACCCT；以人胚胎cDNA文库为模板，RT-PCR扩增hBMP-2基因，RT-PCR的条件是94℃，5min，94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35个循环，72℃，10min。
上述步骤(2)所述载体为pET35b(+)或PBV220。载体为pET35b(+)时，双酶切所用限制性内切酶为Nde I，BamH I；载体为PBV220时，双酶切所用限制性内切酶为BamH I，EcoR I。
上述步骤(2)所述宿主菌为大肠杆菌。
上述步骤(3)所述培养hBMP-2基因工程菌的培养基为LB培养基，载体为pET35b(+)时培养温度为30～32℃；载体为PBV220时培养温度为30℃，诱导温度为42℃。
上述步骤(3)所述分离、清洗、溶解包涵体是将工程菌超声破碎，离心收集沉淀，用溶液1清洗，用溶液2溶解；所述溶液1为2％Triton X-100，50mmol Tris-HCl、pH7.4，1mmol EDTA；所述溶液2为8M尿素，50mmol Tris、pH7.0，1mmol EDTA，0.1Mβ-巯基乙醇。
上述步骤(4)所述纯化包涵体是采用阴离子交换层析纯化，所需填料为DEAE、PEI或QAE；吸附条件为pH在7～9之间；洗脱条件为加盐或改变pH，盐浓度为0.1～0.4mol/LNaCl，pH为7～9之间。
上述步骤(5)所述复性是采用稀释法复性，复性液为pH10.5，50mmol/L碳酸钠，1mol/L氯化钠，20％甘油，0.5μmol/LCuCl2和1mmol/L二硫苏糖醇。
上述步骤(6)所述超滤是采用分子量10000道尔顿的超滤膜超滤，所述透析是采用半透膜对质量百分数0.1％醋酸透析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果大肠杆菌表达的rhBMP-2以包涵体形式存在，成熟的有活性的hBMP-2结构比较复杂，对其进行体外变复性比较困难，本发明在通过大肠杆菌高效表达rhBMP-2的基础上，对影响其复性效率的各种因素进行了定性定量研究，确定了重组人骨形成蛋白-2体外变复性的较为合适的方法，使其复性效率达到50％～60％左右，复性后rhBMP-2的ED50最高为0.71μg/ml，适合进行产业化。本发明工艺简便，成本低，产量高，活性好，复性率可达到60％左右，在产业化生产上具有优势，适于大规模生产。
图1为pET/hBMP-2表达质粒的构建图；图2为rhBMP-2的表达及纯化图；图3为复性后rhBMP-2二聚体非还原及还原的SDS-PAGE图；图4为复性后rhBMP-2在C2C12细胞中碱性磷酸酶活性的测定图。
其中，图1中，1为pET35b(+)，2为NdeI+BamHI，3为PCR产物，M为λ-Hind III；图2中，1为未诱导的菌体总蛋白，2为诱导后菌体总蛋白，3为复性前经纯化的rhBMP-2，M为蛋白marker；图3中，1为非还原电泳，2为还原电泳，3为纯化后的rhBMP-2二聚体，4为对照品，M为蛋白marker。
具体实施例方式
实施例1(1)设计上游引物ATCGCATATGGGCCTAACCTTCTTTTGAAGCTTATTCAA，下游引物ACGTGGATCCCTATTAGCAACACCCACAACCCT；以人胚胎cDNA文库为模板，PCR扩增BMP-2基因，PCR条件是94℃，5min，94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35个循环，72℃，10min。1.5％的琼脂糖凝胶电泳，在342bp处可见一明显条带，与预计产物大小相吻合。(图1)(2)切胶回收经PCR扩增后的hBMP-2基因，用NdeI+BamHI双酶切后的hBMP-2和pET35b(+)后，按照常规方法连接，并转化到DH5α感受态细胞。在平板上随机挑选几个克隆，抽提质粒，用NdeI+BamHI酶切鉴定重组子，同时重组子通过公司测序确定序列的准确度，测序结果与设计一致。
(3)挑选表达量最高的重组子，按1％接种量将其接入装有5mlLB培养基的培养瓶中，过夜，次日按1％转接至500ml LB培养基中，培养至OD600＝0.2，加IPTG至终浓度1mM，继续培养4小时。8000转/分30min离心收集菌体，PBS重悬，超声破碎菌体，8000转/分30min离心收集包涵体。
(4)将包涵体用溶液1清洗，8000转/分30min离心，收集沉淀，并用溶液2溶解。所述溶液1为2％Triton X-100，50mmol/Ltris-HCl，1mmol/LEDTA，pH7.0；所述溶液2为8mol/L尿素，50mmol/Ltris-HCl，1mmol/LEDTA，0.1mol/L β-巯基乙醇。
(5)用DEAE-Sephorase(Pharmacia公司产品)填料装柱(30cm×3cm)，用20mmol/LPBS+8M尿素(pH 8.0)平衡，将待纯化样品上样，上样量为30mL，上样完成后用平衡液冲洗至基线，再用0.25mol/LNaCl+8M尿素+20mmol/LPBS(pH 7.0)洗脱柱子，收集洗脱峰。(图2)(6)将上述洗脱峰收集液通过稀释法复性，复性液为pH10.5，50mnol/L碳酸钠，1mol/L氯化钠，20％甘油，0.5μmol/LCuCl2及1mmol/L二硫苏糖醇。复性时蛋白终浓度为0.2mg/ml，复性时间为48小时。
(7)复性后的蛋白通过分子量为10000道而顿的超滤膜超滤，然后对质量百分数0.1％醋酸透析后，冻干。(图3)(8)细胞法测定对C2C12细胞诱导表达ALP的生物活性，方法参照有关文献。经复性的rhBMP-2活性高于对照。复性后的rhBMP-2活性分别是0.71μg/ml，对照品(R&D systems)为1.2μg/ml。(图4)试验表明，本发明通过独特的工艺，简便的方法，使BMP-2的大规模生产成为现实。大肠杆菌表达BMP-2，成本低，产量高，由于我们的工艺复性率可达到60％左右，因此，在产业化生产上具有优势。
权利要求
1.一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法，其特征在于包括如下步骤(1)目的基因hBMP-2的合成；(2)双酶切hBMP-2基因与载体，连接构建重组载体，转化宿主菌，构建hBMP-2基因工程菌；(3)培养hBMP-2基因工程菌，分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液；(4)纯化包涵体；(5)复性；(6)超滤、透析、冻干得到重组人骨形成蛋白-2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述目的基因的合成为设计上游引物ATCGCATATGGGCCTAACCTTCTTTTGAAGCTTATTCAA，下游引物ACGTGGATCCCTATTAGCAACACCCACAACCCT；以人胚胎cDNA文库为模板，RT-PCR扩增hBMP-2基因，RT-PCR的条件是94℃，5min，94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35个循环，72℃，10min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述载体为pET35b(+)或PBV220；载体为pET35b(+)时，双酶切所用限制性内切酶为Nde I，BamH I；载体为PBV220时，双酶切所用限制性内切酶为BamH I，EcoR I。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述宿主菌为大肠杆菌。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)所述培养hBMP-2基因工程菌的培养基为LB培养基；载体为pET35b(+)时培养温度为30～32℃；载体为PBV220时培养温度为30℃，诱导温度为42℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)所述分离、清洗、溶解包涵体是将工程菌超声破碎，离心收集沉淀，用溶液1清洗，用溶液2溶解；所述溶液1为2％Triton X-100，50mmol Tris-HCl、pH7.4，1mmol EDTA，所述溶液2为8M尿素，50mmol Tris、pH7.0，1mmol EDTA，0.1M β-巯基乙醇。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)所述纯化包涵体是采用阴离子交换层析纯化，所需填料为DEAE、PEI或QAE；吸附条件为pH在7～9之间；洗脱条件为加盐或改变pH，盐浓度为0.1～0.4mol/LNaCl，pH为7～9之间。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(5)所述复性是采用稀释法复性，复性液为pH10-11，50mnol/L碳酸钠，1mol/L氯化钠，5-20％甘油，0.1-1μmol/LCuCl2及1-10mmol/L二硫苏糖醇。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(6)所述超滤为采用分子量10000道尔顿的超滤膜超滤，所述透析是采用半透膜对0.1％醋酸透析。
全文摘要
本发明公开了一种重组人骨形成蛋白－2的表达方法。包括目的基因hBMP－2的合成；用Nde I和BamH I双酶切hBMP－2基因与载体，连接构建重组载体，转化宿主菌，构建hBMP－2基因工程菌；培养hBMP－2基因工程菌，分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液；纯化包涵体；复性；超滤、透析、冻干得到重组人骨形成蛋白－2。本发明工艺简便，成本低，产量高，活性好，复性率可达到60％左右，在产业化生产上具有优势，适于大规模生产。
文档编号C07K1/14GK1869216SQ200610032800
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月13日 优先权日2006年5月13日
发明者汪炬, 孙奋勇, 戴云, 谢秋玲 申请人:暨南大学