专利名称：重组人骨形成蛋白－7成熟肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及采用基因工程手段，利用大肠杆菌表达制备能够用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽。
美国学者Urist发现了骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)证实了骨形成的诱导学说，从而为难治性和以往无法治愈的骨缺损和骨损伤提供了潜在的治疗途径。临床前动物实验证实了骨形成蛋白对各种骨缺损和骨损伤具有良好的治愈作用，提示骨形成蛋白具有良好的临床应用前景，将其应用于临床将产生巨大的社会和经济效益。
骨形成蛋白主要存在于骨组织中，但从骨组织中提取骨形成蛋白方法繁杂、获取量低、重复性差、难以得到足够量的骨形成蛋白单一纯品，而且临床上最好是应用人的骨形成蛋白(hBMP)，但人骨组织来源困难，限制了人骨形成蛋白的应用。人骨形成蛋白-2和人骨形成蛋白-7作为诱骨活性强、临床应用前景好的诱骨因子，美国、日本已在COS细胞、CHO细胞和昆虫细胞等真核系统中表达了人骨形成蛋白-2和人骨形成蛋白-7，产物具有较强的诱骨活性，其中美国的人骨形成蛋白-2和人骨形成蛋白-7现已进入III期临床；但真核系统表达产量低、生产成本高，限制了它的应用。国内和德国的研究组先后采用生产成本低、操作简单的大肠杆菌表达系统来制备有良好诱骨活性的不同形式的重组人骨形成蛋白，主要是表达制备人骨形成蛋白-2完整成熟肽(人骨形成蛋白-2羧基端114肽，人骨形成蛋白的完整结构都是由介导分泌到细胞外的信号肽和帮助形成正确空间结构后被切除的前肽以及体内发挥生物学作用的成熟肽三部分组成)。而国内外尚没有别的课题组利用大肠杆菌系统获得具有诱导成骨能力的人骨形成蛋白-7成熟肽。
本发明提供了利用大肠杆菌系统表达制备具有良好生物活性的人骨形成蛋白-7成熟肽。
下列序列表是编码人骨形成蛋白-7完整成熟肽(羧基端139肽)的基因序列和人骨形成蛋白-7成熟肽(羧基端103、110、139肽)氨基酸序列。
序列表<110>上海惠谷生物技术开发有限公司<120>利用大肠杆菌表达制备的重组人骨形成蛋白-7<160>4<210>1<211>417<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>mat_peptide<222>(1)...(417)<223>n＝a或g或c或t<220><221>人骨形成蛋白-7成熟肽(完整)的基因编码序列<222>(1)...(417)<400>1tccacgggga gcaaacagcg cagccagaac cgctccaaga cgcccaagaa ccaggaagcc160ctgcggatgg ccaacgtggc agagaacagc agcagcgacc agaggcaggc ctgtaagaag61 120cacgagctgt atgtcagctt ccgagacctg ggctggcagg actggatcat cgcgcctgaa121 180ggctacgccg cctactactg tgagggggag tgtgccttcc ctctgaactc ctacatgaac181 240gccaccaacc acgccatcgt gcagacgctg gtccacttca tcaacccgga aacggtgccc241 300aagccctgct gtgcgcccac gcagctcaat gccatctccg tcctctactt cgatgacagc301 360tccaacgtca tcctgaagaa atacagaaac atggtggtcc gggcctgtgg ctgccac361 417<210>2<211>139<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><221>人骨形成蛋白-7成熟肽(全长)氨基酸序列<222>(1)...(139)<220><221>DISULFID<222>(38)...(104)；(67)...(136)；(71)...(138)；(103)...(103)<400>2Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys Asn Gln1 5 10 15Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln20 25 30 35Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp40 45 50Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala55 60 65 70Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu75 80 85 90Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln95 100 105Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys110 115 120 125Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His130 135 139<210>3<211>110<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><221>人骨形成蛋白-7成熟肽(截短突变体)氨基酸序列<222>(1)...(110)<220><221>DISULFID<222>(9)...(75)；(38)...(107)；(42)...(109)；(74)...(74)<400>3Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe1 5 10 15Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr20 25 30 35Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn40 45 50His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys55 60 65 70Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp75 80 85 90Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly95 100 105Cys His110<210>4<211>103<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><221>人骨形成蛋白-7成熟肽(截短突变体)氨基酸序列<222>(1)...(103)<220><221>DISULFID<222>(2)...(68)；(31)...(100)；(35)...(102)；(67)...(67)<400>4Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp1 5 10 15Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala20 25 30 35Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu40 45 50Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln55 60 65 70Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys75 80 85 90Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His95 100 103附注<110>申请人姓名、名称<120>发明名称<160>序列表中序列个数<170>序列表电子文件的软件版本信息<210>序列标识符<211>序列的长度<212>序列的类型<213>生物体<220>特征<221>名称/关键词<222>位置<223>其他信息<400>核苷酸序列和/或氨基酸序列为达到上述发明目的，本发明的技术方案以如下方式实现用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7，其主要步骤包括(1)利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方式获取所需的编码人骨形成蛋白-2成熟肽的基因序列；(2)采用基因工程手段利用大肠杆菌表达重组人骨形成蛋白-7成熟肽；(3)通过表达产物的纯化、变性复性和进一步纯化后获得具有良好活性的人骨形成蛋白-7成熟肽；(4)将适当剂量的重组入骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程产物与胶原、羟基磷灰石、珊瑚、聚乳酸和异种骨基质等植骨材料复合后，得到用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽，能够有效的修复人以及动物的颅骨、下颌骨、股骨、胫骨和尺骨等多种自身无法愈合的骨缺损，治疗效果明显优于单纯的植骨材料或自体骨移植。
按照上述技术方案，所利用基因手段为大肠杆菌表达系统表达载体为pBV220及其一系列衍生的载体，宿主菌为JM103、JM105、BL21系列、DH5α等大肠杆菌。
按照上述技术方案，所属人骨形成蛋白-7成熟肽的基因序列为编码入骨形成蛋白-7羧基端103-139肽的基因序列包括其突变体以及其与别的基因的融合体。
图2是表达载体pDHEX-B7(110)构建过程。。
图3是表达载体pLDH99-B7(139)构建过程。
以下结合具体实施方法和实验例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式实施方法1.编码入骨形成蛋白-7的成熟肽基因的获得根据已经发表的人骨形成蛋白-7的基因全序列，设计聚合酶链式反应(PCR)引物，从胎骨、牙组织或胎肾或胎盘cDNA文库中扩增得编码人骨形成蛋白-2羧基端139肽的基因序列(见附件序列表)。2.人骨形成蛋白-7羧基端103，110，139肽(见附件序列表)的重组表达将利用聚合酶链式反应(PCR)获得的编码人骨形成蛋白-2羧基端103，110，139肽基因序列分别克隆到大肠杆菌表达载体pBV220(图谱见附
图1)、pDHEX(图谱见附图2)和pLDH(图谱见上附图3)，转化大肠杆菌JM105或DH5α，分别得到表达人骨形成蛋白-7羧基端103、110和139肽的稳定工程菌，目标产物的表达量达细菌总蛋白的20％-50％。3.人骨形成蛋白-7羧基端103，110，139肽基因工程产物的获得工程菌经过高密度发酵后，裂菌获得以包涵体形式表达的目标产物，经过6-8摩尔/升的尿素或6摩尔/升的盐酸胍变性溶解，再离子层析(和反相层析)纯化达到90％以上的纯度后，在含有低浓度变性剂(0.5-4摩尔/升的尿素或/和0.5-3摩尔/升盐酸胍)、低浓度(体积百分比0.05-1％)去垢剂(如Triton X100、TritonX114、吐温20、吐温80、十二烷基肌氨酸钠、十六烷基溴化铵、NP40、Brij35)、合适的氧化还原体系(如0.1微摩尔/升-0.1毫摩尔/升的铜离子或/和还原剂/氧化剂比例为摩尔比从10∶1到1∶2，其中还原剂的浓度范围在0.05-10毫摩尔/升，所使用的还原剂可以是还原型谷胱甘肽、半胱氨酸及其盐酸盐、巯基乙醇、半胱氨、二硫苏糖醇、二硫赤癣糖醇，所使用的氧化剂可以是氧化型谷胱甘肽、氧化型的二硫苏糖醇和二硫赤癣糖醇、胱氨酸及其盐酸盐、胱氨)、以及其它复性添加剂(如0.05-10克/升的聚乙二醇4000或聚乙二醇6000或聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，0.02-1.0摩尔/升的精氨酸及其盐酸盐或其它碱性氨基酸及其盐酸盐或三(羟甲基)氨基甲烷，1％-20％的甘油及一定量的肝素)的偏碱性(pH7-11)复性液中复性12-48小时，再经过进一步层析纯化(离子交换、反相、疏水、非特异亲和及分子排阻)使目的蛋白的纯度达到98％以上，然后经除菌、分装和冷冻干燥后得到人骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程产物。
实例1将1毫克3种人骨形成蛋白-7成熟肽(羧基端103、110、139肽)基因工程产物与珊瑚复合，用于治疗兔颅骨标准骨缺损(直径1.5厘米的圆洞，自身不能修复)，单纯珊瑚和自体松质骨移植作为对照。3个月左右，无论从大体解剖还是X射线检查以及组织学切片检查，都证明人骨形成蛋白-7成熟肽与珊瑚复合治疗组的骨缺损得到很好的修复；而且人骨形成蛋白-7成熟肽与珊瑚复合治疗组在新骨形成速度和形成量上均优于自体松质骨移植治疗组，更是明显优于单纯珊瑚治疗组。实例2将人骨形成蛋白-7成熟肽(羧基端103、110、139肽任意其中之一)基因工程产物1毫克与羟基磷灰石复合可以很好的修复兔下颌骨大面积缺损(8毫米×15毫米)，组织形态学分析表明在手术后3个月含人骨形成蛋白-7成熟肽基因工程产物的移植物有60％以上被新骨组织所取代，而单纯材料对照组少于10％。
权利要求
1.一种用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽，其特征在于(1)利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)所取得编码人骨形成蛋白-7羧基端103-139肽的基因序列；(2)利用基因工程手段利用大肠杆菌系统高效表达了人骨形成蛋白-7羧基端103-139肽；(3)通过该表达产物的诱导表达、包涵体纯化、变性溶解、复性和纯化后获得有生物活性的人骨形成蛋白-7羧基端103-139肽基因工程产物；(4)将适量的人骨形成蛋白-7羧基端103-139肽基因工程产物与多种植骨材料复合后，得到用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽。
2.根据权利要求1所述的一种用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽，其特征在于其中所述的人骨形成蛋白-7成熟肽完整的基因编码序列如下tccacgggga gcaaacagcg cagccagaac cgctccaaga cgcccaagaa ccaggaagcc1 60ctgcggatgg ccaacgtggc agagaacagc agcagcgacc agaggcaggc ctgtaagaag61 120cacgagctgt atgtcagctt ccgagacctg ggctggcagg actggatcat cgcgcctgaa121 180ggctacgccg cctactactg tgagggggag tgtgccttcc ctctgaactc ctacatgaac181 240gccaccaacc acgccatcgt gcagacgctg gtccacttca tcaacccgga aacggtgccc241 300aagccctgct gtgcgcccac gcagctcaat gccatctccg tcctctactt cgatgacagc301 360tccaacgtca tcctgaagaa atacagaaac atggtggtcc gggcctgtgg ctgccac361 417
3.根据权利要求1所述的一种用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽，其特征在于其中所述的人骨形成蛋白-7成熟肽全长氨基酸序列如下Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys Asn Gln1 5 10 15Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln20 25 30 35Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp40 45 50Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala55 60 65 70Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu75 80 85 90Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln95 100 105Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys110 115 120 125Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His130 135 139
4.根据权利要求1所述的一种用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽，其特征在于其中所述的人骨形成蛋白-7成熟肽截短突变体氨基酸序列如下Ser Ser Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe1 5 10 15Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr20 25 30 35Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn40 45 50His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys55 60 65 70Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp75 80 85 90Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly95 100 105Cys His110
5.根据权利要求1所述的一种用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽，其特征在于其中所述的入骨形成蛋白-7成熟肽截短突变体氨基酸序列如下Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp1 5 10 15Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala20 25 30 35Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu40 45 50Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln55 60 65 70Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys75 80 85 90Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His95 100 103
6.根据权利要求1所述的一种用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽，其特征在于其中所述利用基因工程手段为大肠杆菌系统，表达载体为pBV220及其一系列衍生的载体，宿主菌为JM103、JM105、BL21系列、DH5α大肠杆菌。
7.根据权利要求1所述的一种用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽，其特征在于其中所述序列编码人骨形成蛋白-7羧基端103-139肽的基因序列包括其突变体以及其与其它的目的基因的融合体。
8.根据权利要求1所述的一种用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白-7成熟肽，其特征在于其中所述重组人骨形成蛋白-7成熟肽包括其衍生的各种复合剂型和缓释剂型。
全文摘要
本发明属基因工程技术领域。本发明公开了用于修复骨损伤和骨缺损的重组人骨形成蛋白－7成熟肽，其步骤包括(1)利用反转录聚合酶链式反应获取编码人骨形成蛋白－7成熟肽(羧基端103－139肽)的基因序列；(2)利用基因工程手段获得人骨形成蛋白－7成熟肽的重组表达产物；(3)通过对表达产物的纯化、变性和复性获得具有良好活性的重组人骨形成蛋白－7成熟肽产物；(4)将适量人骨形成蛋白－7成熟肽基因工程产物与植骨材料复合后，能有效地修复多种无法或难以治愈的骨缺损。
文档编号A61P19/00GK1475577SQ0213681
公开日2004年2月18日 申请日期2002年9月5日 优先权日2002年9月5日
发明者蒲勤, 柴玉波, 李毅, 陈富林, 孙唯一, 蒲 勤 申请人:上海惠谷生物技术开发有限公司