一种用于检测肾癌的引物组及检测方法与流程

本发明涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测肾癌的引物组及检测方法。
背景技术：
：肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，学术名词全称为肾细胞癌，又称肾腺癌，简称为肾癌，是最常见的肾脏实质恶性肿瘤，由于平均寿命延长和医学影像学的进步，肾癌的发病率比前增加，肾癌患者的主诉和临床表现多变，容易误诊为其他疾病。肾位置隐蔽，与外界主要的联系是尿，因此血尿是发现肾癌最常见的病状，但血尿的出现必须在肿瘤侵入肾盂后方才有可能，因此已不是早期病状。因此对肾癌的早期诊断十分必要。目前肾癌的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括X射线、CT扫描、超声扫描、核磁共振检查等，但是其效率较低并且检测准确度不高。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者穿刺的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害，甚至可能造成穿刺道肿瘤转移。近来，循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的CTC细胞。采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。目前RT-PCR方法检测肾癌CTCs检测的标准还没有建立。我们通过检测肾癌患者的CTCs特征基因，确定肾癌CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物，包括NK和CAR-T免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测的试剂盒，通过联合检测MN/CA9，TS，CYP3A4，PD-L1，VEGFR2，cadherin-6，CK19，CD24和EPCAM9个基因实现肿瘤的早期筛查或诊断。本发明设计运用靶向特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到96％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测肾癌的引物组及检测方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测肾癌的引物组，包含：本发明的引物组可通过以下两种方法实现肾癌的检测。方法1：PCR方法。(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。方法2：荧光定量PCR方法(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。本发明的有益效果在于：本发明通过设计特异性PCR引物，开发出用于肾癌早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的PCR体系可对MN/CA9，TS，CYP3A4，PD-L1，VEGFR2，cadherin-6，CK19，CD24和EPCAM基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测肾癌检出率可达到96％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性强，正常人或非肾癌病人样本很少会产生特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。附图说明图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性PCR图。图2为实施例中非肾癌患者外周血样本检测阴性PCR图。图3为实施例中非肾癌患者肿瘤组织检测阴性PCR图。图4为实施例中肾癌患者外周血检测阳性PCR图。图5为实施例中肾癌患者肿瘤组织检测阳性PCR图。图中，M.100bpmarker；1.B2M，2.MN/CA9，3.TS，4.CYP3A4，5.PD-L1，6.VEGFR2，7.cadherin-6，8.CK19，9.CD24，10.EPCAM。具体实施方式本发明针对目前肿瘤中主要的驱动性突变基因，联合检测MN/CA9，TS，CYP3A4，PD-L1，VEGFR2，cadherin-6，CK19，CD24和EPCAM9个基因实现肾癌的早期筛查或诊断。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述9个基因的一整套特异性引物组。根据上述9个基因的参考序列设计特异性扩增引物，其PCR产物长度最优是在180-200bp之间，退火温度不高于60度，GC含量在40-60％之间，符合一般引物设计软件的要求。通过采用实时荧光PCR反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。本发明结合附图和实施例作进一步的说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的(带标记的)探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1:基因选择多项研究表明，单基因筛查敏感度约为20-60％，大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测，其检测敏感度或特异度偏低，不能满足临床需要。采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题，提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度。为了提高早期肿瘤的检出率，提高肿瘤患者的治愈率，改善病人预后，我们对肾癌和正常组织的差异表达基因进行了筛选。我们通过大量比对实验发现MN/CA9，TS，CYP3A4，PD-L1，VEGFR2，cadherin-6，CK19，CD24和EPCAM组成的基因组对肾癌具有较高的检出率，达到96％，相对于现有的检测技术，产生了意想不到的技术效果，具有显著的进步。实施例2:引物筛选(1)设计引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具体为：利用生物信息学软件对靶基因A-I序列进行分析，利用序列分析软件设计特异性引物组，利用NCBI引物搜索软件检测各配对引物在人基因组中的特异性，分别设计出3对特异性扩增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；表1：PCR检测引物(2)外周血样品的处理收集某医院收治并经病理证实的肾癌患者外周血，清晨7点，空腹，经肘静脉采集新鲜血液，存放于抗凝管中，摇匀，常温下保存≤4h。2.1将抗凝管中的全血样本加入等体积PBS(pH7.0)，于室温3000rpm离心5min，去除上层血浆；2.2加入等体积氯化铵红细胞裂解液(可购自碧云天)，于室温200rpm离心8min混匀后，以3000rpm室温离心5min，弃去上清；2.3将下层血细胞和生理盐水按照体积比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分离液，混合液与Ficoll分离液的体积比为1:2～2:1，离心力为700g，离心20～40min；2.4吸弃上清，取细胞沉淀，洗涤，即得到PBMC；2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保护剂重悬，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混匀；3.2将裂解液转移至gDNA清除离心型柱中，8000×g(10,000rpm)离心30s。收集流穿液，弃离心柱；3.3加入1倍体积的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混匀；3.4将样品转移至RNeasyMinElute离心柱，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；3.5在RNeasyMinElute离心柱中加入700μLBufferRW1，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；3.6在RNeasyMinElute离心柱中加入500μLBufferRPE，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；3.7将RNeasyMinElute离心柱置于新的2mL收集管中，打开盖子，全速离心5min，使乙醇挥发；3.8将RNeasyMinElute离心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，盖紧盖子，全速离心1min洗脱RNA。(4)模板cDNA的获得4.1准确测得样品RNA浓度；4.2严格按照cDNA反转录试剂盒说明书在冰上制备反转录体系；成分体积5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL4.3轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，55度20min，85度2min，获得模板cDNA；(5)普通PCR扩增用TaqDNA聚合酶配置反应体系，用引物为a-i和人内参基因(B2M)进行PCR扩增各样品，产物用1％凝胶检测；扩增体系成分体积2×Mix10μLcDNA1μL引物-F0.8μL引物-R0.8μLRNase-freeH2O7.4μLPCR反应条件是95℃预变性3分钟，1个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃延伸7分钟。(6)荧光实时定量PCR扩增根据设计的特异引组a-i，通过荧光定量PCR进行扩增，体系如下：95℃预变性20s，1个循环；95℃10s，60℃30s，40个循环；每管设立三个复孔；根据步骤5和6的pcr结果，筛选出以下引物组，作为本发明用于检测肾癌的引物组。实施例3：效果验证根据实施例2的筛选结果，采用下表所述的引物组对100个肿瘤样本进行检测。其中，CD10的正向引物为TGATGATAAGAATTCTGTGA，反向引物为GCAAGCTGGTTTTCATCGAT，N-cadherin的正向引物为CCTTAACTGAGGAGTCAGTG，反向引物为CAGACCTGATCCTGACAAGC，Vimentin的正向引物为CGTGACGTACGTCAGCAATA，反向引物为AAGGGCATCCACTTCACAGG。1～8号引物组的检出率如上表所示，从表中可以看出，引物组中，随着引物数量的增加，在一定程度上可以提高其检出率。进一步地，通过比较5～8号引物组可以发现，引物组内的组合对于检出率的高低有重要影响。同时在相同的检测基因数量情况下，5号引物组的检出率高于6～8号引物组。因此，我们优选5号引物组的基因组合用于肾癌的检测。进一步通过研究发现，5号引物组中，CK19的表达可提示上皮细胞来源的肿瘤,被认为有肿瘤转移诊断价值；EPCAM的表达可提示上皮源性恶性肿瘤细胞,MN/CA9是碳酸酐酶家族成员，在正常人组织中极少表达，在肾恶性肿瘤中呈现高表达；TS是DNA生物合成的关键酶，与肿瘤的恶性生物学行为密切相关；CYP3A4是CYP3A亚家族的主要成员，也是成人肝微粒体CYP450中最重要的成分，现已发现CYP3A4参与了大约38个类别共150多种药物(约占全部药物50％)的代谢，对肿瘤治疗用药有指导作用；活化的T细胞与肿瘤相关蛋白PD-L1之间的相互作用导致细胞程序性死亡，临床研究表明，PD-L1表达与不良预后和/或疾病进展相关；VEGFR-1与血管内皮生长因子(VEGF)相互作用影响肿瘤血管和淋巴管；cadherin-6在组织的生长发育中发挥重要作用，与肿瘤细胞的浸润和转移相关；CD24在促进肿瘤细胞增殖、黏附及转移过程中发挥着重要作用，同时CD24过表达与肿瘤患者的不良预后相关。由上可知，本发明并不是将9对引物进行简单叠加组合，9对引物相铺相成，在功能上彼此支持，使得检出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技术效果。综上所述，本专利中选择的基因涉及肿瘤的代谢、增殖、侵袭等方面，可较为全面的检测出肾癌的细胞生物学特征。实施例4：特异性分析根据实施例2的筛选结果，采用下表所述的引物组对正常人外周血样本(图1)、非肾癌病人的外周血(图2)和组织样本(图3)、肾癌病人的外周血(图4)和组织样本(图5)进行检测。结果如图1-5所示，从图中可见所述的引物组在正常人外周血(图1)、非肾癌病人的外周血(图2)和组织样本(图3)中均未检测到较强的基因的表达。在肾癌病人的外周血(图4)和组织样本(图5)中可检测到多个基因的强表达，分别为6/9和9/9，说明本发明中所述引物组具有相当高度的特异性。当前第1页1 2 3