提供组织修复的含微颗粒的具有协同作用的真皮基质及其生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于治疗慢性创伤的真皮基质及其生产方法，所述真皮基质能够实现真皮组织的快速修复，并且在其结构中包括具备协同作用的含抗氧化剂的微颗粒。
【背景技术】
[0002]在当今的慢性创伤治疗中，使用了诸如乳剂、凝胶、洗液和软膏等常规产品。为了使所述产品在治疗中有效，它们需要频繁施用。此外，施用剂量也必须被标准化。
[0003]然而现有治疗可以消除这些问题，其是常规方法的一部分。在这样的治疗应用中，使用异种移植和移植物转移(graft transfer)方法，以便在大规模组织损失的区域上更换新组织。这些方法均是疼痛的，且同时可能具有基于供体的缺点。
[0004]慢性创伤治疗中已知的最新的最终阶段包括创新制剂。与现有技术方法相比，微颗粒系统和基质系统提供了有利的治疗方法。作为进行文献研究的结果，观察到已开发出了包含协助区域愈合的试剂的基质，其提供了必要的机械支持，从而通过闭塞效应对因各种损伤而损失的组织区域进行补偿。已制备了真皮基质，其特别地包括胶原蛋白-壳聚糖、胶原蛋白-明胶，胶原蛋白-糖胺聚糖以及胶原蛋白-透明质酸组合物，并通过向它们孵育成纤维细胞来制备，并且已观察到了创伤组织的愈合。
[0005]真皮基质是为了有效支持细胞生长和发育而用天然或合成的聚合物制备的系统，并且这些真皮基质在创伤治疗中的使用开辟了一个新的视野。这些结构的主要目的是使受损的组织重建，并将不同的生物材料和生物活性分子运载到该区域。
[0006]现今存在具有不同特点的使上皮愈合的商购产品。在所述产品中，使用了用壳聚糖(其是天然聚合物)制备的创伤贴片，或者使用诸如合成聚氨酯和PLGA等聚合物，并且提供了其中角质形成细胞在上皮中形成小集落的介质，从而获得了更快的上皮形成。在替换上皮的所述产品中，提供了二维结构。然而，此种在上皮形成中优选的维度在需要三维结构的替代治疗中是不足的。
[0007]创伤区域易患感染和类似的并发症，并且防止感染的最有效方法是尽快提供有效治疗。受伤后的头六小时对细菌拓殖而言是更重要的时间段。防止感染的最有效方法是通过以下方式封闭创伤:在创伤上使用无菌贴片，并且在用无菌贴片封闭创伤前在无菌条件下清理创伤，这些条件甚至比抗生素治疗更有效。出于此原因，立即覆盖创伤、增加真皮层的自我修复并且发育出完全分层的组织(其会替换组织区域)是当前研究中需要解决的一些重要课题。
[0008]用于治疗创伤的常规方法(软膏、乳剂、凝胶、洗液)不能克服一些基本问题，例如创伤感染，脱水，热损失，活组织仍未受保护，蛋白质、红细胞、白细胞、免疫因子和微量元素的损失。
[0009]常规制剂的最重要的缺点之一是施用的量可能变化或改变，因此施用的剂量不能被标准化，并且需要频繁进行施用。每次进行施用时，病人都会感觉疼痛，这使得治疗过程更加困难。此外，由于表面活性剂或者这些制剂中所用的诸如防腐剂和香料等成分，也会出现过敏反应。除了常规疗法，作为在大规模组织损失的情况下进行的另一种疗法，移植物转移也具有许多缺点。这些缺点可以是由供体传播的疾病，或者是在取走移植物的供体区域形成新创伤。尽管自体移植为优选的材料，但在某些情况下在患者中可能不会有任何适合的可转移组织。除此之外，在取走移植组织的区域会出现新的创伤。另一个缺点是这些过程可能需要外科手术。为了防止诸如感染等并发症并克服所述缺点，认为创新方法对于缩短治疗时间是必要的。
[0010]为了达到这些目的而制备的具有胶原蛋白、壳聚糖和明胶的制剂是二维系统，并且所述二维系统不足以提供物理支持。为了解决此问题，用于确保用胶原蛋白制备的真皮基质是包含化学材料的三维系统的方法会破坏细胞生长所需的条件。在现有技术中，为达到所述目的而开发的产品不包含微颗粒，并且其作用类似于使细胞可略微更快生长的创伤贴片。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是提供一种真皮基质，其提高慢性创伤治疗的效率、缩短愈合时间并确保组织修复。
[0012]本发明的另一目的是提供一种真皮基质，其不仅包含胶原蛋白和层粘连蛋白，而且还包含携带抗氧化剂的微颗粒，所述抗氧化剂有助于通过展现协同作用而加快组织修复速度。
[0013]本发明的另一目的是获得一种能够实现组织修复的真皮基质生产方法，其中使用由位于真皮天然结构内的蛋白质形成的试剂及其它组分。
[0014]本发明的另一目的是提供一种真皮基质生产方法，其通过采用并非化学方法的交联方法而支持细胞生长和组织修复。
[0015]本发明的另一目的是提供一种真皮基质生产方法，其能够实现组织修复，并且通过实施冻干工序而防止热敏性生物材料降解。
【具体实施方式】
[0016]附图中示出了为了达到本发明的目的而产生的真皮基质生产方法，其提供组织修复，其中所述附图图示了以下内容；
[0017]表1是本发明的方法的流程图。
[0018]具有协同作用并提供组织修复的真皮基质生产方法(10)，其特征在于，其包括以下步骤:
[0019]制备真皮基质系统(11)，
[0020]制备胶原蛋白溶液系统(111)，
[0021 ]将层粘连蛋白添加到胶原蛋白溶液上并混合(112)，
[0022]冷冻并储存混合物(113)，
[0023]将储存的混合物冻干(114)，
[0024]使冻干物交联(115)，
[0025]形成微颗粒(12)，
[0026]制备聚合物的水溶液(121)，
[0027]制备磷脂、抗氧化剂和醇混合物(122)，
[0028]将水溶液添加到醇混合物上并且混合(123)，
[0029]喷雾干燥所得到的全部混合物(124)，
[0030]将微颗粒与真皮基质系统组合(13)。
[0031]本发明的方法(10)主要基于:分别制备真皮基质系统和微颗粒系统，其后将微颗粒喷洒到真皮基质上，从而将这两个系统物理组合。
[0032]根据本发明的方法(10)，首先通过将胶原蛋白添加到酸性酸溶液中制备胶原蛋白溶液(111)，从而制成真皮基质系统(11)。在本发明的优选应用中，将牛胶原蛋白以0.1%的浓度添加至0.1M的酸性酸溶液中(111)。
[0033]接下来，将层粘连蛋白添加到胶原蛋白溶液上(112)。在本发明的优选实施方式中，取2.5ml已制备的胶原蛋白溶液，添加20μ1层粘连蛋白，并且将其全部在冰浴中混合
(112)。当使用冰浴时，其目的在于防止存在于混合物内的蛋白质结构劣化。在本发明的优选实施方式中，用10-G探针以3000转/分钟的速度进行混合1分钟。
[0034]将包含胶原蛋白和层粘连蛋白的混合物在-20±1°C的温度下搁置12小时并冷冻
(113)。在此之后，对已冷冻的所述混合物进行24小时的冻干(114)。由此确保防止所述混合物内的热敏性生物材料劣化。
[0035]利用紫外交联仪(UV交联仪)设备在254nm波长下对已获得的包含胶原蛋白和层粘连蛋白的冻干结构物进行交联(115)。在另一处，为了提供微颗粒的形成(12)，制备聚合物水溶液(121)。为了确保这一点，使用0.2g透明质酸钠盐(HA)并将其溶于150ml纯水中。在此期间，将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和白藜芦醇混合在醇中并溶解(122)。在本发明的优选实施方式中，将0.7g?0.75g的DPPC和0.05g?0.lg白藜芦醇350ml添加到乙醇中并混合(122)。使用白藜芦醇(抗氧化剂)显示出与形成蛋白结构物的胶原蛋白和层粘连蛋白的协同作用，并因此提高了最终产物对于组织修复的效率。此外，确保了长时间保持最终产物的基质完整性。
[0036 ] 将已制备的HA溶液(121)添加到DPPC和白藜芦醇的醇溶液(122)上并在40 ± 1°C混合(123)。将已制备的全部混合物置于喷雾干燥器中，并且通过喷雾获得微颗粒(124)。在本发明的优选实施方式中，已调节喷雾干燥器以使初始温度为180°C，且喷雾速度为400L/h。
[0037]将用喷雾干燥器制备的负载有白藜芦醇的HA微颗粒作为干粉喷到预先制备的真皮基质(11)上，并且将所述两个系统组合(13)。根据本发明优选实施方式，喷洒的微颗粒包括50μΜ白藜芦醇。已获得的这些基质特别用于慢性创伤治疗，并且其