一种用于检测结直肠癌的引物组及检测方法与流程

本发明涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测结直肠癌的引物组及检测方法。
背景技术：
：结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，全世界新诊断的结直肠癌病例数接近每年一百万。随着经济水平的升高，饮食结构的改变，我国结直肠癌的发病率也日渐增高，已跃居第3～5位；死亡率位居恶性肿瘤死亡谱的第4或第5位。据预测，结直肠癌将成为我国最常见的发病率上升的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率在今后很长一段时期内仍将稳步上升。morson早在1974年提出“腺瘤—癌变”学说，认为结直肠癌的发生发展必然要经过一个腺瘤的形成过程，其演变约需10—15年。流行病学资料也显示大肠腺瘤性息肉与结直肠癌的发生呈正相关。这一连续性的病理进展需要较长的阶段，即存在较长的癌前病变期。术前无转移者根治后10年生存率可达半数以上。因此结直肠癌早期筛查和诊断非常关键。早期结直肠癌往往无明显症状，从建立的高危人群中筛查病例，使被动接受就诊者转为主动筛查是早期发现结直肠癌的有效途径，相关研究越来越受到国内外学者的重视。结直肠癌的确诊有赖于肠镜及其活检的病理诊断，但内镜属有创检查，可能带来不适和并发症，患者接受程度较低。有效的非侵袭性血液检测可能为发现结直肠癌的理因此对结直肠癌的早期诊断十分必要。目前结直肠癌的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括ct扫描、核磁共振检查等。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者肠镜的方法从患者上获取肿瘤组织的检材，目前在我国，尚没有普及。目前，临床常用的监测结直肠癌的肿瘤标志物主要有癌胚抗原(cea)、糖链蛋白19-9(ca19-9)等，用于病理学诊断结直肠癌免疫组化指标有环氧合酶-2(cox-2)、拓扑异构酶ii(topoii)、ki67等。cea由gold和freedman从结肠腺癌中提出，为较广谱、非特异性肿瘤标记物，属于人类胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白。cea已经被医学界接受并且为国际肿瘤学协会推荐，主要用于肿瘤复发的监测。cea在95％的结直肠、胃和胰腺肿瘤以及多数的乳腺、肺和头颈部肿瘤均有升高。也有报道良性疾病的患者cea水平升高，以及许多结直肠癌尤其在疾病早期患者cea水平正常近来，循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，ctcs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。ctcs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。ctcs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，ctcs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。ctc的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过ctc表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获ctc。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的ctc细胞。采用rt-pcr的方法检测ctc细胞的特异性基因是ctc细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集ctcs，然后通过rt-pcr的方式检测特定基因的mrna，以此判断ctcs是否存在，并通过检测ct值的变化给ctcs定量。这种方法检测ctcs费用低，敏感度高，而且容易自动化。目前rt-pcr方法检测结直肠癌的ctcs检测的标准还没有建立。通过检测结直肠癌患者的ctcs特征基因，能够确定结直肠癌ctcs的检测方法和检测标准。这些方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物，包括nk和car-t免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测的试剂盒，通过联合检测epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck199个基因实现肿瘤的早期筛查或诊断。本发明设计运用靶向特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到95％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测结直肠癌的引物组及检测方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的,一种用于检测肠癌的引物组，包含：本发明的引物组可通过以下两种方法实现神经母细胞瘤的检测。方法1：pcr方法。(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个pcr反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、rna酶抑制剂、dna聚合酶、dntp；其中，pcr反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；(2)进行反转录和pcr反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。方法2：荧光定量pcr方法(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个pcr反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、rna酶抑制剂、dna聚合酶、dntp；分别加入2×chamqsybrqpcrmastermix，其中，pcr反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；(2)进行反转录和pcr反应，并实时检测荧光；(3)根据荧光检测结果计算出的ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。本发明的有益效果在于：本发明通过设计特异性pcr引物，开发出用于肠癌早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的pcr体系可对epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck19基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测肠癌检出率可达到95％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性强，正常人或非肠癌病人样本不会产生非特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。附图说明图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性pcr图。图2为实施例中乳腺癌患者外周血样本检测阴性pcr图。图3为实施例中乳腺癌患者癌组织样本检测阴性pcr图。图4为实施例中结直肠癌患者外周血检测阳性pcr图。图5为实施例中结直肠癌患者肠癌组织检测阳性pcr图。图中，m.100bpmarker；1.epcam；2.her2；3.egfr；4.cea；5.muc1；6.cd10；7.ck8；8.ck18；9.ck19；10.b2m。具体实施方式本发明针对目前肿瘤中主要的驱动性突变基因，联合检测epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck199个基因实现结直肠癌的早期筛查或诊断。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述9个基因的一整套特异性引物组。根据上述9个基因的参考序列设计特异性扩增引物，其pcr产物长度最优是在180-200bp之间，退火温度不高于60度，gc含量在40-60％之间，符合一般引物设计软件的要求。通过采用实时荧光pcr反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。本发明结合附图和实施例作进一步的说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》第三版(coldspringharborlaboratorypress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《rna实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的(带标记的)探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1:基因选择多项研究表明，单基因筛查敏感度约为20-60％，大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测，其检测敏感度或特异度偏低，不能满足临床需要。采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题，提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度。guya.weiss等人(weissga,samuelst,ustwanioa,etal.circulatingtumorcellsingastrointestinalmalignancies[j].translationalgastrointestinalcancer,2013,2(3).)同时检测epcam、her2、egfr、cea基因，结果表明联合检测三个基因用于肠癌早期诊断的敏感度为63％，准确率达75.2％。为了提高早期肿瘤的检出率，提高肿瘤患者的治愈率，改善病人预后，我们对肠癌组织和正常组织的差异表达基因进行了筛选。我们通过大量比对实验发现epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck19组成的基因组对肠癌具有较高的检出率，达到95％，相对于现有的检测技术，产生了意想不到的技术效果，具有显著的进步。实施例2:引物筛选(1)设计引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具体为：利用生物信息学软件对靶基因a-i序列进行分析，利用序列分析软件设计特异性引物组，利用ncbi引物搜索软件检测各配对引物在人基因组中的特异性，分别设计出3对特异性扩增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；表1：pcr检测引物(2)外周血样品的处理本实施例的实验材料是收集某医院收治并经病理证实的结直肠癌患者外周血，清晨7点，空腹，经肘静脉采集新鲜血液，存放于抗凝管中，摇匀，常温下保存≤4小时。1.将抗凝管中的全血样本加入等体积pbs(ph7.0)，于室温3000rpm离心5min，去除上层血浆；2.加入等体积氯化铵红细胞裂解液(可购自碧云天)，于室温20rpm离心8min混匀后，以3000rpm室温离心5min，弃去上清；3.将下层血细胞和生理盐水按照体积比1:2～2:1混合后，加入ficoll分离液，混合液与ficoll分离液的体积比为1:2～2:1，离心力为700g，离心20～40min；4.吸弃上清，取细胞沉淀，洗涤，即得到pbmc；5.取pbmc用于核酸提取，多余的pbmc用rna保护剂重悬，保存于-20度。(3)核酸的提取1.取不多于5×105的pbmc，加入250μlbufferrltplus，吹打混匀；2.将裂解液转移至gdna清除离心型柱中，8000×g(10,000rpm)离心30s。收集流穿液，弃离心柱；3.加入1倍体积的70％乙醇(350μl)至流穿液中，吹打混匀；4.将样品转移至rneasyminelute离心柱，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；5.在rneasyminelute离心柱中加入700μlbufferrw1，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；6.在rneasyminelute离心柱中加入500μlbufferrpe，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；7.将rneasyminelute离心柱置于新的2ml收集管中，打开盖子，全速离心5min，使乙醇挥发；8.将rneasyminelute离心柱置于新的1.5ml收集管中，加入20μlrnase-freeh2o，盖紧盖子，全速离心1min洗脱rna。(4)模板cdna的获得1.准确测得样品rna浓度；2.严格按照cdna反转录试剂盒说明书在冰上制备反转录体系；成分体积5×mix8μlrna500ngrnase-freeh2o至40μl轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，55度20min，85度2min，获得模板cdna；(5)普通pcr扩增用taqdna聚合酶配置反应体系，，用引物为a-i和人内参基因(b2m)进行pcr扩增各样品，产物1％凝胶检测；扩增体系pcr反应条件是95℃预变性3分钟，1个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃延伸7分钟。(6)荧光实时定量pcr扩增根据设计的特异引组a-i，通过荧光定量pcr进行扩增，体系如下：95℃预变性20s，1个循环；95℃10s，60℃30s，40个循环；每管设立三个复孔；根据步骤5和6的pcr结果，筛选出以下引物组，作为本发明用于检测结直肠癌的引物组。实施例3：效果验证根据实施例2的筛选结果，采用下表所述的引物组对100个肿瘤样本进行检测。序号多基因联合检测检出率1epcam、her2、egfr、cea、muc170％2epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd1072％3epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck876％4epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck1879％5epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck1998％6epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、htert83％7epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、mage181％8epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、cd9084％其中，htert的正向引物为ctgagctgtactttgtcaag，反向引物为agacgtggctcttgaaggcc，mage1的正向引物为ctctgagtccttgcagctgg，反向引物为ccgccctccattgcaatcat，cd90的正向引物为atgaacctggccatcagcat，反向引物为cttctttgtctcacgggtca。1～8号引物组的检出率如上表所示，从表中可以看出，引物组中，随着引物数量的增加，在一定程度上可以提高其检出率。进一步地，通过比较5～8号引物组可以发现，引物组内的组合对于检出率的高低有重要影响。同时在相同的检测基因数量情况下，5号引物组的检出率高于6～8号引物组。因此，我们优选5号引物组的基因组合用于结直肠癌的检测。进一步通过研究发现，5号引物组中，epcam是一种由ga-733-2基因编码的分子量为40kda的跨膜糖蛋白，作为嗜同种的钙非依赖性的上皮细胞间粘附分子在上皮癌变过程中发挥着作用。cea抗原决定基为糖蛋白，而肿瘤细胞的浸润和转移均与细胞膜糖蛋白的糖基化改变有关。egfr二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路，包括y992,y1045,y1068,y1148andy1173等激活位点。这个自磷酸化可以引导下游的磷酸化，包括mapk，akt和jnk通路,诱导细胞增殖。muc1是由muc1基因表达的一种高糖基化(糖化大于50％)、高分子量(mr＞200×103)蛋白,又称附膜蛋白，是跨膜分子，它在上皮更新与分化，维持上皮完整性和癌的发生与转移等方面都起到重要的作用。由上可知，本发明并不是将9对引物进行简单叠加组合，9对引物相铺相成，在功能上彼此支持，使得检出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技术效果。综上所述，本发明中选择的基因涉及肿瘤的代谢、增殖、侵袭等方面，可较为全面的检测出结直肠癌的细胞生物学特征。实施例4：特异性分析根据实施例2的筛选结果，采用下表所述的引物组对正常人外周血样本、非结直肠癌病人的外周血和肿瘤组织样本、结直肠癌病人的外周血和组织样本进行检测。图中1-10基因分别为：1.epcam；2.her2；3.egfr；4.cea；5.muc1；6.cd10；7.ck8；8.ck18；9.ck19；10.b2m。检测结果如图1-5所示，从图中可见所述的引物组在正常人外周血(图1)、非结直肠癌病人的外周血(图2)和肿瘤组织样本(图3)中均未或较弱检测到基因的表达。在结直肠癌病人的外周血(图4)和组织样本(图5)中可检测到多个基因的强表达，分别为5/9和8/9,说明本发明中所述引物组具有高度的特异性。当前第1页12