羊肚菌抗白霉病性能的鉴定方法与流程

本发明与羊肚菌抗白霉病的鉴定方法有关。

背景技术：

羊肚菌(morchella)是一种名贵的食药两用真菌，含有丰富的人体必需氨基酸、多糖和萜类化合物，具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、保肝保肾等活性作用。随着羊肚菌栽培规模的扩大，病虫害成为限制羊肚菌产业发展的重要因素。白霉病是羊肚菌最常见的病害，是由paecilomycespenicillatus引发，自2012年全国广泛商业栽培以来，白霉病发病率呈现逐渐增高的态势，因此，加强对羊肚菌白霉病的防控、加快对羊肚菌白霉病的抗病品种选育是推动羊肚菌产业发展的必然要求。

梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌是我国目前最广泛栽培的两个商业化品种，据调查统计，不同羊肚菌品种在白霉病抗性方面有一定的差异，因此，亟需挖掘一种科学规范的抗白霉病羊肚菌的鉴定方法，从而推动羊肚菌抗病品种的挖掘，以促进羊肚菌产业的发展。

作物病害防控和抗病性鉴定需要人工接种手段，田间活体接种需要较大的场地，工序复杂，且接种后条件不易控制。羊肚菌作为一种大田仿生栽培的大型真菌，外界环境因素（如温度、水分、土壤理化等）对白霉病的发生和发病表现有重要的影响。田间接种进行抗性鉴定方法中发病子实体相互传染，鉴定的准确性差，鉴定效。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种操作简单，准确性高，效率高的羊肚菌抗白霉病性能的鉴定方法。

本发明是这样实现的：

1、羊肚菌抗白霉病性能的鉴定方法，其特征在于步骤如下：

（1）接种器皿准备：将玻璃平皿、滤纸片、蒸馏水和镊子进行121℃，30min高压蒸汽灭菌，用细铁丝将无菌透气封口膜固定成下端开口的圆柱体模型，此圆柱体模型是为了避免在早期羊肚菌子实体受白霉病病原菌侵染，从而提高试验的准确性，灭菌备用，

(2)接种病原菌的准备：接种白霉病病原菌paecilomycespenicillatus收集于四川省农业科学院土壤肥料研究所，将白霉病病原菌活化转接到pda培养基上，pda培养基组成：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，在28℃培养箱中培养5d，将菌落作为接种材料，

(3)羊肚菌子实体准备：将步骤(1)中若干无菌封口膜模型盖在刚形成的至少两种羊肚菌子实体上，两天后，带上无菌手套，采集的健康的至少两品种羊肚菌：揭开无菌封口膜模型，将每种羊肚菌子实体连土部分拔起，用干净的毛刷去除菌柄底部的土壤，将采集的每种羊肚菌子实体用干净的器皿带回室内备用，

(4)白霉病病原菌接种：将步骤(1)处理后的灭菌滤纸片置于培养皿底部，随后倒入适量的灭菌蒸馏水，待滤纸片浸湿后，将多余的水分倒出，用无菌镊子将步骤(3)中处理好的每种羊肚菌子实体分别夹入不同的培养皿，用无菌镊子取1mm²步骤(2)处理后的病原菌菌落接种于羊肚菌子实体菌盖中部，盖好培养皿盖，以接种1mm²无菌pda培养基做对照，对照的意义是为了证明白霉病病斑是由接种发病引起，而不是自然发病引起，试验才具有科学性。

(5)接种后处置：将步骤(4)处理过后的培养皿置于具有100-300lux散射光的室内培养，室内温度设为18-22℃，接种96h后，用叶面积仪测定每种羊肚菌子实体菌盖及病斑的面积，根据计算白霉病病斑占羊肚菌菌盖的比例大小，从而衡量各种羊肚菌品种抗白霉病性能的好坏。

本发明的优点在于：

(1)所用器具简单，所需空间小，操作简便。

(2)发病症状与田间一致，易于识别和统计。

(3)接种条件可控，能有效提高抗性鉴定效率。本发明方法96h即可判断不同羊肚菌品种的抗性差异，比田间接种鉴定时间缩短50%以上。

(4)能提高抗白霉病羊肚菌鉴定的准确性。本发明方法可避免田间白霉病病原菌传染（自然发病干扰达10%以上），发病病斑单一，便于识别和统计，能准确鉴定羊肚菌对白霉病的抗性。

（(5）)本发明能提高抗白霉病羊肚菌鉴定效率50%以上。

（(6）)本发明发病症状与田间一致，发病病斑单一，便于识别和统计，重现性好，能有效避免田间接种发病子实体相互传染，从而提高鉴定的准确性。

附图说明

图1生长期2d的梯棱羊肚菌离体接种发病情况。

图2生长期2d的六妹羊肚菌离体接种发病情况。

图3生长期4d的梯棱羊肚菌离体接种发病情况。

图4生长期4d的六妹羊肚菌离体接种发病情况。

图5田间接种表现。

具体实施方式

实施例1：

(1)接种器皿准备：将玻璃平皿、滤纸片、蒸馏水和镊子进行121℃，30min高压蒸汽灭菌，用细铁丝将无菌透气封口膜固定成圆柱体模型，灭菌备用。

(2)接种病原菌的准备：接种病原菌paecilomycespenicillatus收集于四川省农业科学院土壤肥料研究所，将病原菌活化转接到pda培养基上(土豆200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000ml)，在28℃培养箱中培养5d，将菌落作为接种材料。

(3)羊肚菌子实体准备：将步骤(1)中无菌封口膜模型盖在刚形成的羊肚菌子实体上，带上无菌手套，采集处置2d的健康梯棱羊肚菌品种，将羊肚菌子实体连土部分拔起，用干净的毛刷去除菌柄底部的土壤，将采集的子实体用干净的器皿带回室内备用。

(4)白霉病病原菌接种：将步骤(1)处理后的灭菌滤纸片置于培养皿底部，随后倒入适量的灭菌蒸馏水，待滤纸片浸湿后，将多余的水分倒出。用无菌镊子将(3)中处理好的羊肚菌子实体夹入培养皿，用无菌镊子取1mm²步骤(2)处理后的病原菌菌落接种于羊肚菌菌盖中部，盖好培养皿盖，以接种1mm²无菌pda培养基做对照。

(5)接种后处置：将步骤(4)处理过后的培养皿置于具有100-300lux散射光一定散射光的室内培养，室内温度设为18-22℃，于接种后96h统计白霉病病斑占羊肚菌菌盖的比例。，结果表现为：a1，b1：接种48h后的症状；a2，b2接种96h后的症状；c1，c2：对照在48h后和96h后的表现。接种96h后病斑所占比例为：11.8%±1.4%。

实施例2：

按实施例一步骤(1)(2)操作实施。羊肚菌子实体准备：将步骤(1)中无菌封口膜模型盖在刚形成的六妹羊肚菌子实体上，带上无菌手套，采集处置2d的健康六妹羊肚菌品种，将羊肚菌子实体连土部分拔起，用干净的毛刷去除菌柄底部的土壤，用干净的器皿带回室内备用。之后按实施案例一步骤(4)(5)实施，结果表现为：a1，b1：接种48h后的表现；a2，b2接种96h后的表现；c1，c2：对照在48h后和96h后的表现。接种96h后病斑所占比例为：8.6%±0.7%。

实施案例3：

按实施案例一步骤(1)(2)操作实施。羊肚菌子实体准备：将步骤(1)中无菌封口膜模型盖在刚形成的梯棱羊肚菌子实体上，带上无菌手套，采集处置4d的健康梯棱羊肚菌品种，将羊肚菌子实体连土部分拔起，用干净的毛刷去除菌柄底部的土壤，用干净的器皿带回室内备用。之后按实施案例一步骤(4)(5)实施，结果表现为：a1，b1：接种48h后的表现；a2，b2接种96h后的表现；c1，c2：对照在48h后和96h后的表现。接种96h后病斑所占比例为：7.1%±1.0%。

实施例4：

按实施案例一步骤(1)(2)操作实施。羊肚菌子实体准备：将步骤(1)中无菌封口膜模型盖在刚形成的六妹羊肚菌子实体上，带上无菌手套，采集处置4d健康六妹羊肚菌品种，将羊肚菌子实体连土部分拔起，用干净的毛刷去除菌柄底部的土壤，用干净的器皿带回室内备用。之后按实施案例一步骤(4)(5)实施，结果表现为：a1，b1：接种48h后的表现；a2，b2接种96h后的表现；c1，c2：对照在48h后和96h后的表现，接种96h后病斑所占比例为：3.8%±0.6%。

通过以上4个实施案例结果可看出，生长期2d的梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌接种96h后病斑所占的比例分别为11.8%±1.4%和8.6%±0.7%，生长期4d的梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌接种96h后病斑所占的比例分别为7.1%±1.0%和3.8%±0.6%，可见无论哪个生长时期，六妹羊肚菌接种后的病斑比例更小，表现了对羊肚菌白霉病更高的抗性，这与田间两个栽培品种抗病表现结果一致，可见通过本发明的实施，能够准确鉴定抗白霉病羊肚菌的抗性。

对照试验例：

为了更进一步判断本发明方法相比于田间活体接种鉴定的准确性和效率，在同步情况下进行了田间接种鉴定。

(1)将接种镊子进行121℃，30min高压蒸汽灭菌，用细铁丝将无菌透气封口膜固定成圆柱体模型，灭菌备用。

(2)接种病原菌的准备：接种病原菌paecilomycespenicillatus收集于四川省农业科学院土壤肥料研究所，将病原菌活化转接到pda培养基上(土豆200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000ml)，在28℃培养箱中培养5d，将菌落作为接种材料。

(3)羊肚菌子实体准备：将步骤(1)中无菌封口膜模型盖在刚形成的梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌子实体上，2d后备用接种。

(4)白霉病病原菌接种：用无菌镊子取1mm²步骤(2)处理后的病原菌菌落接种于羊肚菌菌盖中部，以接种1mm²无菌pda培养基做对照。

(5)接种后处置：接种后按自然条件对栽培羊肚菌进行管理，每隔48h观察接种羊肚菌的发病情况，并用叶面积仪计算病斑占羊肚菌菌盖的比例。

a1梯棱羊肚菌接种96h表现；a2，梯棱羊肚菌接种144h表现；b1，六妹羊肚菌接种96h表现；b2，六妹羊肚菌接种144h表现；c1，c2，其他因素导致羊肚菌子实体产生白霉病。

根据白霉病病斑的统计结果，田间梯棱羊肚菌病斑占菌盖的比例为6.5%±0.8%，六妹羊肚菌病斑面积占菌盖面积的比例为3.5±0.7%，表现为六妹羊肚菌对白霉病抗性更强。从结果还可以看出，田间接种96h后，发病程度很轻，无法进行科学的病斑统计，接种144h后病斑表现和离体接种相当，可见，本发明能提高抗白霉病羊肚菌鉴定效率50%以上。此外，由于田间影响因素众多，易发生自然感染10%以上，病斑遍布于羊肚菌子实体，不利于羊肚菌的抗性统计，这说明本发明能提高羊肚菌抗白霉病性能鉴定的效率和准确度。