用于鉴别西洋参的多重pcr特异引物对及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材鉴定技术领域，具体设及基于多重PCR鉴别西洋参的引物对及 其方法。
【背景技术】
[0002] 西洋参PanaxquinquefoliumL.为五加科植物Araliaceae人参属Panax西洋参 的干燥根，又名花旗参，原产加拿大蒙特利尔、加拿大安大略省和美国康斯威星州，我国市 场上的西洋参主要有两种：一种是进口，一种是引进种植。我国从20世纪70年代开始引 进种植，随着长期引进栽培种植及生产实践的筛选，形成中国西洋参的=大主产种植区：东 北、北京和山东。大量实验数据表明：国产西洋参与进口西洋参的皂巧总含量、分组皂巧成 分种类与含量均基本相同，国产西洋参于1988年被定为新药，明确规定国产西洋参与进口 西洋参同等入药。五加科人参属Panax主要药用植物为：人参PanaxginsengC.A.Mey.、 西洋参PanaxquinquefoliumL.和S屯Panaxnotoginseng(Burkill)F.H.Chenex C.化ow&W.G.化ang;人参主要产于我国东北S省和朝鲜，S屯主产于云南、广西。S者都是 我国常用的珍贵药材，但其价格差异很大；人参、=屯自1963年起历版《中国药典》均有收 载，西洋参自《中国药典2000年版一部》起有收载W。上述=者由于来源于同科同属不同 种植物的相同部位，因而其内部组织构造、所含化学成分均有很大相似之处，给实际工作中 的鉴定增加了难度，对于鉴别单味及成方制剂，难度就更大。所W，市场上经常出现用其它 根类药材，如人参充作西洋参；但人参和西洋参药性和功效差异较大，人参具补气、固脱、生 津、益智、安神的功效；西洋参具有补气养阴，益胃生津、清热除烦之功效；但二者的形态、 性状十分相似，特别是国内栽培西洋参和栽培人参很难根据传统的形态学特征进行准确鉴 另IJ，两者的饮片和粉末更是难W区别。市场存在相互混用的情况，由于=者药性和药效有很 大区别，而传统的分析鉴别方法，是根据形态和组织结构特征和化学成分上鉴别，而运些传 统的鉴别方法干扰因素较多，易受环境和植物本身的影响和限制；故要求采用先进的鉴定 技术进行区分，从而保证患者的用药安全。因此，市场需求一种不依赖于其形态特征的鉴别 西洋参的方法。
[0003] 随着科学的不断前步，应用DNA分子标记技术鉴定中药材及其饮片，取得了快速 地发展，在中药材真伪鉴别中发挥了重要的辅助鉴定作用，具有操作简单、准确性高、稳定、 成本低等优点；不受样品形态的限制，可应用于原药材、饮片、粉末乃至含有生药原型的中 成药（丸剂、散剂等）；所需检样量小，对珍稀贵重类药材及化石标本的鉴定更具应用价值； 将先进的分子生物学技术与传统研究结合起来，是中药研究现代化的重要手段，现行《中 国药典》2010年版一部采用聚合酶链式反应法，作为乌梢蛇、薪蛇炮制品的质量评定方法， 标志着分子生物学技术已经作为法定的中药鉴定方法之一，扩充了中药鉴定的科学内涵。 目前，尚未有任何公开或报道过采用特异性多重PCR的方法实现西洋参的快速、准确鉴别。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于多重PCR鉴别西洋参的引物及方 法。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
[0006] 所述多重PCR引物对包括引物对1和引物对2 :
[0007] 所述引物对1的序列为：
[0008]UP:5' -GTTTTTTMAAAGAAAAGATAAAAATG-3'（沈Q IDNO. 1);
[0009]LO:5'-CCCTACTATTCTTTTCCTTACGTT-3'（沈Q IDNO. 2)。
[0010] 所述引物对2的序列为：
[0011]UP:5,-CGCCCTTCTCATAAGATGTTG-3'(沈Q IDNO.3);
[0012]LO:5'-CCCTTCATCGAAAGAGTAGGC-3'(沈Q IDNO. 4)。
[0013] 所述利用多重PCR鉴定西洋参的方法包括如下步骤：
[0014] (1)采用常规方法提取待测样品的DNA，然后采用本发明所述的多重PCR引物对对 待测样品的总DNA进行PCR扩增反应，得扩增产物；
[0015] 所述多重PCR扩增反应体系总体积为25 y L PCR扩增反应体系包括：5XPrimer STAR Buffer (Mg2+plus) 5.0yL，dNTPs mixUire (2. 5mM)3yL，鉴别引物对 1(2 yM) 2 yL，弓I 物对2(2. 5yM)lyLPrimeSTAR服DNA Polymerase灯akara，2. 5U/yL)0. 25yLDNA模板 1. 0y以无菌双蒸水补充体系至25 yL ;
[0016] 所述PCR扩增反应的参数如下：95°C预变性3min，98°C变性10s，50°C退火15s， 72°C延伸lmin，30个循环后，72°C延伸7min，4°C保存；
[0017] 似电泳所述扩增产物，若待测样品获得两条分子量约为400bp和150bp大小的特 异带型，则确定待测样品为西洋参。
[0018] 本发明构建了特异性多重PCR引物对1和引物对2,由于人参、西洋参及S屯基 因组高度相似，要寻找其差异DNA片段是一个难点，因此本发明的引物设计从两个方面着 手，引物对1是根据捜索Genbank中人参、西洋参、S屯的psbA-tr址基因序列（登录号： 册112864 ;册112888 ;册112884)，根据其变异区设计出一对特异性引物，引物对2是在前期 实验的基础上，通过RATO标记筛选特异性片段（SEQIDNO. 7)，对其特异片段进行回收、TA 克隆和测序，获得了差异性DNA序列并根据测序序列设计特异性引物，该序列是通过RAPD 技术筛选获得的特异性DNA片段，此前并未公开报道。
[001引下面进行列举：
[0020] -、西洋参、人参、立屯鉴别引物所错定的序列具有种内高度保守的特点，且=者 之间存在较小的差异：
[0021] 1.人参、西洋参和=屯分别在NCBI进行Blast相似度比较，具有高度的相似度， 95%W上，差别极小。
[0022] 人参和S屯序列Blast比较，相似度96 %。
[0023] 西洋参和S屯序列Blast比较，相似度95%。
[0024] 二、在西洋参、人参、S屯鉴别引物设计的过程中，前期一共设计了 20余对引物试 图能将西洋参、人参、=屯鉴别出来，在引物设计从两方面设计，一是采用一对引物进行鉴 另IJ，二是采用多重PCR的方法进行鉴别。现略举数例W作说明引物设计的艰难筛选过程： [00巧]1UP5, -GGGATATCGGATAAACCAAACAACT- 3,（SEQIDNO. 8)
[0026]LO5, -TCGGATAAACCAAACAACTCTACAAAC-3,（SEQIDNO. 9)
[0027] 采用普通Taq酶做的溫度梯度，人参、西洋参、S屯各2个样本，无特异条带。
[0028] 采用hkarafrimeSTAR服DNAPolymerase)热启动酶，人参、西洋参、S屯各2 个样本，退火溫度54°C，无特异条带。
[0029] 2UP5' -GTCCCGACGAGATAGCCGAA- 3'（SEQIDNO. 10)
[0030]LO5, -GTCCCGACGATAATGAATATTTTATAACCA-3'（SEQIDNO. 11)
[0031] 采用普通Taq酶做的溫度梯度，人参、西洋参、S屯各2个样本，无特异条带。
[0032]采用l'akara(P;rimeSTAR服DNAPolymerase)热启动酶，人参、西洋参、S屯各 2 个样本，退火溫度54°C;人参、西洋参出现相同的条带，所W，不能鉴别西洋参。
[0033] 3UP5, -CGCCCTTCTCATAAGATGTTGTAAGCTAC- 3,（SEQIDNO. 12)
[0034]LO5' -CCCTTCATCGAAAGAGTAGGCGGT-3'(沈QIDNO. 13)
[0035] 采用l'akara(P;rimeSTAR服DM Polymerase)热启动酶，人参1个、西洋参1个、 =屯2个样本，退火溫度54°C;西洋参和=屯出现相同的条带，而且扩增出很多杂带，所W， 无特异条带，不能鉴别西洋参。
[0036] 4义用Takara(P;rimeSTAR服DNAPolymerase)热启动酶，选择两对引物一起扩 增，人参、西洋参、=屯各2个样本，退火溫度54°C;人参、西洋参出现相同的条带，而且扩增 出很多杂带，所W，无特异条带，不能鉴别西洋参。
[0037] 引物对1:
[0038]UP5, -TCCCGACGAGATAGCCGAAGACTTAACA- 3,（SEQIDNO. 14)
[0039]LO5' -CTCGCTTTCATTTTCGTTTCCAACTCCC-3'(沈QIDNO. 15)
[0040] 引物对2
[0041]UP5' -CTAGTTTCTTTAAATAAATTTAAAAAAAAC- 3'（SEQIDNO. 16)
[0042]LO5, -CCCCCTACTATTCTTTTTTC-3'（沈QIDNO. 17)
[0043] 5多重PCR方法建立的难点是该体系中各因素的确定，特别是各对引物的浓度比 例和稳定性的摸索，本申请方法是经过多次摸索和条件优化而确定最优反应体系。W下略 举：
[0044]=水平=因素正交实验（设计见表1)
[0045]表