一种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重pcr检测引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于转基因检测技术领域，设及一种快速筛查我国进口转基因油菜外源基 因的六重PCR检测引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 根据农业部官方网站提供的信息，目前我国已进口用作加工原料的转基因油菜转 化事件有9个。随着转基因产品在市场上所占份额的不断增加给转基因检测带来更多需求 的。同时，转基因作物的多样性和复杂性，也给转基因产品的检测带来了挑战。如何快速、准 确、科学地对样品进行转基因鉴定，是当前转基因检测行业所面临的一个关键问题。转基因 筛查是转基因检测中最基础的一步，筛查得到的正确结果，可有效指导转化事件的进一步 鉴定。
[0003] 在转基因植物及产品检测技术中主要有蛋白质检测和核酸检测两类，核酸检测技 术中普通PCR技术在实际检测需求中运用较多，其特点为敏感、快速、简便，主要用于检测转 基因作物及产品中的单个外源基因。然而在产品检测时，往往需要对多个外源基因进行检 测来确认其含哪些转基因成分W及是否为转基因产品，用普通PCR技术分别对运些外源基 因进行检测时，存在时间和试剂耗费大、操作繁琐等缺点。
[0004] 多重PCR是在普通PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加 入两对或W上引物，同时扩增多个核酸片段，解决了普通PCR存在的缺点。多重PCR已在病理 学、微生物、基因组学等学科中得到了广泛应用。多重PCR检测技术主要利用多重扩增产生 长度不同的扩增片段，采用普通琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳分辨出长度不同的片 段。普通琼脂糖凝胶电泳存在操作繁杂，试验周期长，易造成试验室污染等缺点，而毛细管 凝胶电泳可在PCR后直接上机电泳，无需其他点样等操作，节约时间，减少污染。可W说多重 PCR相比单一PCR反应更快捷、更经济，只需要1次PCR反应就能同时检测多个祀标基因，运种 方法具有更大的可靠性和适应性，并能降低检测成本。
[0005] 目前关于我国进口用作加工原料的转基因油菜的检测技术，主要集中在单一调控 元件或单个转化事件PCR方法和标准，也有学者针对目前我国进口用作加工原料的转基因 油菜进行单一PCR筛查检测技术研究，但尚无针对目前我国进口用作加工原料的转基因油 菜的多重PCR筛查检测技术。通过对目前我国进口用作加工原料的转基因油菜基因元件分 析发现，每种转基因油菜都含有多个外源基因元件，并且为了增加检测的可靠性，开发一种 能同步筛查检测我国进口用作加工原料的转基因油菜外源基因至少两次的多重PCR检测方 法就显得非常有必要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的主要是提供一种准确、快速、可靠、省时省力的六重PCR快速筛查我 国进口用作加工原料的转基因油菜外源基因的检测方法。
[0007] 本发明通过下述技术方案实现：
[0008] -种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重PCR检测引物，包括W下引物 序列：
[0021] 一种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重PCR检测方法，包括W下步骤：
[0022] (1)合成W下引物：
[0035] (2)制备待测油菜的DNA稀释液；
[0036] (3)配制PCR反应体系；
[0037] (4)进行 PCR 检测；
[0038] (5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
[0039] 进一步地，步骤（1)中pat引物的浓度为0.3皿ol/L，P-CaMV 35S引物的浓度为0.15 皿01 /L，T-E9 3 '引物的浓度为0.35 '，P-FMV 35巧I物、T-NO巧I物、bar引物的浓度均为0.化 mo 1/1;步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度为SOngAiL。
[0040] 再进一步地，所述PCR反应条件为:94°C变性5min;然后进入35个循环，94°C 30s，58 1：3〇3,721：3〇3;循环结束后72°(：延伸3111111。
[0041 ] 更进一步地，引物退火溫度为58°C。
[0042] 本发明具有W下优点及有益效果：
[0043] 本发明在同一次PCR反应中可W同时检出转基因油菜中使用频率较高的6种外源 基因，并且每种转基因油菜可W检出至少两次。
[0044] 本发明采用毛细管电泳仪进行结果分析，不仅分辨率可达几个碱基(普通凝胶电 泳几乎不能将其分开），而且相对普通凝胶电泳的分离效果更好，并且只需要一次电泳分析 即可得知样品是否含有转基因油菜中使用频率较高的6种外源基因。
【附图说明】
[0045] 图1为本发明六重PCR引物浓度梯度和退火溫度梯度正交优化试验扩增图谱。
[0046] 图2为本发明六重PCR灵敏度试验扩增图谱。
[0047] 图3为本发明六重PCR已知样品验证扩增图谱。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
[0049] 实施例
[0050] -种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重PCR检测方法，包括W下步骤：
[0051] (1)合成W下引物：
[0064] (2)制备待测油菜的DNA稀释液；
[0065] (3)配制PCR反应体系；
[0066] (4)进行 PCR 检测；
[0067] (5)取PCR反应产物进行毛细管电泳。
[006引其中，步骤（1)中pat引物的浓度为0 .化mo 1 /L，P-CaMV 35S引物的浓度为0.15y mo 1 /L，T-E9 3 '引物的浓度为0.35皿01 /L，P-FMV 35S引物、T-NOS引物、bar引物的浓度均为 0.2皿ol/L;步骤(2)所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/化;所述PCR反应条件为:94 °C变 性5min;然后进入35个循环，94°C30s，58°C30s，72°C30s;循环结束后72°C延伸3min;引物退 火溫度为58 °C。
[0069]为了验证本发明的筛查检测效果W及相应的参数选取的真实性，对各步骤进行具 体的验证试验，其具体情况如下：
[0070] (1)扩增检测引物的合成：
[0071] 表1引物序列信息表
[0074] (2)待测转基因 DNA的小量提取：
[00巧]采用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提 取样品基因组DNA，称取转基因粉末样品200mg，加入70iU洗脱液TE洗脱样品基因组DNA，其 他提取步骤参照试剂盒说明书操作。
[0076] 采用化ermo Nano Drop 1000紫外分光光度计测定样品基因组DNA的浓度和纯度， 并将样品DNA浓度稀释至SOngAiL待测。
[0077] (3)六重 PCR
[0078] ①引物浓度梯度和引物退火溫度梯度正交试验：
[00巧]PCR反应体系组成为：PCR Master Mix终浓度为lX，pat、P-FMV35S、T-N0S、P-CaMV 35S、T-E9 3'、bar引物终浓度梯度见表2,待测DNA模板3.化L，补充dd也0至体积为25ii L。
[0080]表2反应体系引物终浓度(皿ol/L)梯度
[0082] 在定性PCR仪上运行如下反应程序:94 °C变性5min;然后进入35个循环，94 °C 30s， 退火 303,721：303;循环结束后72°(：延伸5111111。退火溫度梯度为50