°(：、54°(：、56°(：、58°(：、60 °C、64°C。引物浓度梯度和引物退火溫度梯度采用正交设计进行试验。结果见附图1，其中泳 道M:size maker;泳道1-6对应终浓度梯度1:泳道7-12对应终浓度梯度2;泳道13-18对应终 浓度梯度3;泳道19-24对应终浓度梯度4;泳道25-30对应终浓度梯度5;泳道31-36对应终浓 度梯度6;其中，泳道1-6，、泳道7-12、泳道13-18、泳道19-24、泳道25-30、泳道31-36退火溫 度依次为50 °C、54°C、56 °C、58 °C、60 °C、64°C。
[0083] 结论：由图I结果可知：pat、P-FMV 35S、T-N0S、P-CaMV 35S、T-E9 3'、bar引物终浓 度(皿ol/L)为终浓度3及引物退火溫度为58°C时，各外源基因特异性条带扩增效率更高更 一致。
[0084] ②灵敏度试验：
[0085] PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1 X，引物浓度配比参照引物浓度 梯度试验结果，待测DNA模板终浓度(ng/化)梯度1.5、1、0.3、0.1、0.03,补充d地2〇至体积为 2!5化。
[00化]在定性PCR仪上运行如下反应程序:94 °C变形5min;然后进入35个循环，94 °C 30s， 58°C30s，72°C30s;循环结束后72°C延伸5min。结果见附图2,其中泳道M:size maker,泳道 1-5分别对应浓度梯度1.5、1、0.3、0.1、0.03,泳道6为dd出0对照。
[0087] 结论：由图2结果可知，模板浓度低至0.：3ngAiL条件下，口曰*、？斗1￥355、1'-^5、口-CaMV 35S、T-E9 3'、bar的特异性条带结果能被清晰判断。
[0088] ③已知样品验证试验：
[0089] PCR反应体系组成为:PCR Master Mix终浓度为1 X，引物浓度配比参照引物浓度 梯度试验结果，待测DNA模板3.化L，补充d地2〇至体积为化化。
[0090] 在定性PCR仪上运行如下反应程序:94 °C变性5min;然后进入35个循环，94 °C 30s， 58°C30s，72°C30s;循环结束后72°C延伸5min。结果见附图3,其中泳道M:size maker,泳道 1-17:转基因油菜混合阳性（6173+3。3+145)、转基因油菜1?。1、1?。2、1?。3、]\151、]\158、6173、 0巧235、转基因玉米M0N810、GA21、Btll、NK603、转基因棉花M0N1445、M0N88913、转基因大豆 GTS40-3-2、转基因棉花UX0TT0N25、转基因水稻TT51 -1，18: (1地2〇对照。
【主权项】
1. 一种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重PCR检测引物，其特征在于，包括 以下引物序列： pat-F:5 '-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3 '； pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '； P-FMV 35S-F:5 '-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3 '； P-FMV 35S-R:5 '-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3 '； T-NOS-F：5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'； T-NOS-R:5 '-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 '； P-CaMV 35S-F:5 '-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 '； P-CaMV 35S-R:5 '-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 '； T-E9 3 '-F:5 '-TTATGGCATTGGGAAAACTGT-3 '； T-E9 3，-R:5，-GGTCATTAGAGGCCACGATT-3，； bar-F:5 '-ACCATCGTCAACCACTACATCG-3 '； bar-R:5，-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3，。2. -种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重PCR检测方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1)合成以下引物： pat-F:5 '-CGCGGTTTGTGATATCGTTAAC-3 '； pat-R:5 '-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3 '； P-FMV 35S-F:5 '-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3 '； P-FMV 35S-R:5 '-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC-3 '； T-NOS-F：5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'； T-NOS-R:5 '-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 '； P-CaMV 35S-F:5 '-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 '； P-CaMV 35S-R:5 '-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 '； T-E9 3 '-F:5 '-TTATGGCATTGGGAAAACTGT-3 '； T-E9 3，-R:5，-GGTCATTAGAGGCCACGATT-3，； bar-F:5 '-ACCATCGTCAACCACTACATCG-3 '； bar-R:5，-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3，； (2 )制备待测油菜的DNA稀释液； (3) 配制PCR反应体系； (4) 进彳丁 PCR检测； (5 )取PCR反应产物进行毛细管电泳。3. 根据权利要求2所述的一种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重PCR检测 方法，其特征在于，步骤(1)中pat引物的浓度为0.3μπιο 1 /L，P-CaMV 35S引物的浓度为0.15μ mo 1 /L，Τ-Ε9 3 '引物的浓度为0.35μπιο 1 /L，P-FMV 35S引物、T-N0S引物、bar引物的浓度均为 0.2μπι〇 1 /L;步骤(2 )所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/l·! L。4. 根据权利要求2或3所述的一种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重PCR检 测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为:94 °C变性5min;然后进入35个循环，94 °C 30s，58 °〇3〇8,721€3〇8;循环结束后72°(：延伸31^11。5.根据权利要求4所述的一种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重PCR检测 方法，其特征在于，引物退火温度为58 °C。
【专利摘要】本发明公开了一种快速筛查我国进口转基因油菜外源基因的六重PCR检测引物及检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于多重PCR筛查检测分析。所述检测方法提供了一种检测快速、操作简便、扩增性能好、灵敏度高的转基因筛查检测方法，实现了转基因油菜多个外源基因同步检测。利用毛细管电泳对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明的引物和检测方法为转基因植物提供了一种快速、有效、可靠的高通量筛查检测方法。本发明建立的六重PCR反应体系不仅可以检测进口用作加工原料的转基因油菜外源基因，而且还能扩展到国内外更多的转基因油菜或其他转基因植物的筛查检测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105603112
【申请号】CN201610191257
【发明人】尹全, 宋君, 王东, 张富丽, 刘文娟, 常丽娟, 李忆, 刘勇, 雷绍荣, 郭灵安
【申请人】四川省农业科学院分析测试中心
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年3月29日