耐热萝卜EST‑SSR分子标记、分子标记的引物及其应用的制作方法

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及耐热萝卜EST-SSR分子标记、分子标记的引物及其应用。

背景技术：

分子标记(Molecular Markers)，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记--形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有标记的数量不限，能分析不同生物发育阶段的物种，且不影响目标性状的表达，因此，DNA分子标记较其他方法具有优越性。

DNA分子标记常用的标记方法包括RFLP分子标记、RAPD分子标记和SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记。SSR分子标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。由于每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。由于微卫星可在多个等位基因间显示差异，因而在作物的遗传图谱构建，遗传多样性发析，亲缘关系鉴定，DNA指纹图谱构建，品种鉴定，QTL分析及分子辅助育种中均具有公认的优越性及应用前景。从品种间具广泛位点变异的角度考虑，SSR分子标记比RFLP及RAPD分子标记更具多态性，尤其对花生、六倍体小麦等用常见分子标记技术检测不出很多DNA片段多态性的作物品种来说，具有更大的研究价值和应用前景。

萝卜是我国重要的蔬菜作物，但分子生物学等基础研究相对比较落后，远不能满足育种或其他领域研究的需求，同时，萝卜种质资源丰富，但是栽培品种表型相似性高，遗传背景狭窄，例如，崔娜等人报道了75份萝卜材料的平均等位基因数、平均有效等位基因数以及基因多样性指数的数值都不高，具体地来自韩国白萝卜品种晨晓和雪凤凰等15对萝卜品种之间的相似系数为1.00，表明它们可能具有相同的遗传背景。鉴于此，萝卜不同品种之间区分较为困难，目前尚没有一种有效的SSR分子标记能够区分耐热萝卜品种的纯度。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种耐热萝卜EST-SSR分子标记、分 子标记的引物及其应用，本发明提供的分子标记具有共显性，能够有效区分出耐热萝卜品种，并能进一步对耐热型萝卜品种的纯度进行鉴定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

耐热萝卜EST-SSR分子标记，包括SSR17和SSR75一种或两种；

所述SSR17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述SSR75的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了耐热萝卜EST-SSR分子标记的引物，包括SSR17的正向扩增引物和反向扩增引物，以及SSR75的正向扩增引物和反向扩增引物中的一组或两组；

所述SSR17的正向扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；SSR17的反向扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；

所述SSR75的正向扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；SSR75的反向扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。

本发明提供了所述的耐热萝卜EST-SSR分子标记在品种纯度鉴定中的应用。

优选的，所述耐热萝卜包括夏抗40天。

优选的，所述品种纯度鉴定包括以下步骤：

1)提取待测样品DNA；

2)用权利要求2所述引物对所述步骤1)得到的DNA分别进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)将所述扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到电泳图；

4)比较所述步骤3)得到的电泳图和预定的标准电泳带型，所述标准电泳带型为纯合体父本、纯合体母本和杂合体子一代在电泳图中的带型，若待测样品的带型与所述杂合体子一代的带型一致则判断为子一代杂合体，若待测样品的带型与纯合体父本或纯合体母本的带型一致或与上述三者带型均不一致则判断为非子一代杂合体。

本发明提供了耐热萝卜EST-SSR分子标记，包括SSR17和SSR75一种或两种；所述SSR17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述SSR75的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。本发明得到针对耐热萝卜品种的2个EST-SSR分子标记，并且所述SSR17和SSR75具有共显性表达特性，利用具有共显性关系的2个EST-SSR分子标记对商品种耐热萝卜品种--夏抗40天的群体纯度进行检测，结果显示其纯度高达92％，同田间表型一致，因此，所述2个EST-SSR分子标记能够用于耐热萝卜品种的纯度检测。

附图说明

图1为实施例1中SSR17和SSR75分子标记的PCR电泳图；

图2为实施例2中SSR17分子标记对夏抗40天及其父母亲本扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图3为实施例3中SSR75分子标记对夏抗40天及其父母亲本扩增的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图4为实施例4中SSR17分子标记对子一代群体品种纯度鉴定的电泳图；

图5为实施例5中SSR75分子标记对子一代群体品种纯度鉴定的电泳图；

图6为实施例6中夏抗40品种田间种植情况。

具体实施方式

本发明提供了耐热萝卜EST-SSR分子标记，包括SSR17和SSR75一种或两种；

所述SSR17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述SSR75的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了耐热萝卜EST-SSR分子标记的引物，包括包括SSR17的正向扩增引物和反向扩增引物，以及SSR75的正向扩增引物和反向扩增引物中的一组或两组；

所述SSR17的正向扩增引物的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID No.3所示；所述SSR17的反向扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；

所述SSR75的正向扩增引物的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID No.5所示；所述SSR75的反向扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。

本发明中，所述耐热萝卜优选包括夏抗40天。

本发明中，所述SSR17和SSR75的正反向引物的设计方法是以NCBI网站中公开的萝卜品种EST序列为模板，采用Primer3.0引物设计软件进行设计EST-SSR引物。

本发明中，所述SSR17或SSR75的正反向引物应用到PCR扩增中。所述PCR扩增中优选将SSR17正反向扩增引物和SSR75的扩增引物分别在不同PCR反应体系中扩增。

所述的的PCR扩增中反应体系优选如表1所示。

表1 PCR扩增中反应体系

本发明中，所述PCR扩增过程中反应程序优选如下：

第一步:PCR仪上盖预热104℃；

第二步:94℃预变性3min；

第四步:72℃延伸4min。

所述PCR扩增体系的原料的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的PCR扩增体系的原料即可。本发明实施例中，所述PCR扩增体系的原料购自东盛生物(http://www.dongshengbio.com/)。

本发明提供了所述的耐热萝卜EST-SSR分子标记在品种纯度鉴定中的应用。

本发明中，所述品种纯度鉴定的具体方法优选包括以下步骤：

1)提取待测样品的DNA；

2)用上述技术方案所述引物对所述步骤1)得到的DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)将所述扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到电泳图；

4)比较所述步骤3)得到的电泳图和预定的标准电泳带型，所述标准电泳带型为纯合体父本、纯合体母本和杂合体子一代在电泳图中的带型，若待测样品的带型与所述杂合体子一代的带型一致则判断为杂合体，若待测样品 的带型与纯合体父本或纯合体母本的带型一致则判断为纯合体。

本发明中，所述DNA的提取方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的DNA提取方法即可，例如试剂盒法或CTAB法。

本发明中，所述PCR扩增的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的PCR扩增的方法即可。本发明实施例中，所用的PCR仪为MJ PTC-200 DNA Engine Thermal Cycler。

本发明中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法即可。

本发明中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳过程的电压优选为1200～1500V，更优选为1400V。所述聚丙烯酰胺凝胶电泳过程的电流60mA～80mA，更优选为70mA。

得到待测样品的电泳图后，本发明根据所述待测样品的电泳图和预定的标准电泳带型，得到待测样品的品型。具体的，所述标准电泳带型为纯合体父本、纯合体母本和杂合体子一代在电泳图中的带型，提取纯合体父本、纯合体母本和杂合体子一代的DNA，按照上述技术方案所述PCR扩增方案和聚丙烯酰胺凝胶电泳方案，得到纯合体父本、纯合体母本和杂合体子一代的电泳图。

本发明中，所述杂合体子一代为夏抗40天。所述夏抗40天萝卜品种的来源从商业途径购买。本发明实施例中，所述夏抗40天萝卜品种的来源购自武汉七叶红都市园艺有限公司。本发明中，所述夏抗40天的品种是由武汉市蔬菜科学研究所选育的耐热白皮萝卜品种，该萝卜已经2000年完成成果验收。所述夏抗40天萝卜品种的父本和母本的试验材料叶片从武汉市蔬菜科学研究所获得。

本发明中，所述SSR17或SSR75分子标记的引物扩增得到的电泳图可单独用来鉴定品种纯度，也可以将SSR17和SSR75分子标记扩增得到的两个电泳图结合起来鉴定品种纯度。

下面结合实施例对本发明提供的耐热萝卜EST-SSR分子标记及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

根据NCBI中公开的萝卜EST序列，采用Primer3.0引物设计软件，设计SSR引物，通过南京金斯瑞公司合成SEQ ID No.3～SEQ ID No.62对SSR引物。

提取耐热萝卜-夏抗40天及其父母亲本的DNA，具体包括以下步骤：

1、将萝卜幼嫩叶片放入2ml平底EP管中，放入液氮中。

2、迅速研磨直至成粉末状。

3、取出EP管迅速加入0.6ml预热到65℃的CTAB溶液(2％CTAB 20gm CTAB、20mM EDTA、100mM Tris-Cl pH 8.0、1.4M NaCl溶于一升水中

调整pH 7.5-8.0，灭菌后加0.2％巯基乙醇)，快速混匀后放置在65℃干浴器中20min,每5min缓慢颠倒一次。

4、用剪口的枪头吸出上清液到新的EP管中，加入300ul氯仿、异戊醇(体积比24:1)，混匀5min。

5、1500g离心10min。

6、取出上清，重复第4-5步。

7、取出上清，加入400ul异丙醇。混匀后离心12000rpm，10min。

8、用76％乙醇溶液润洗一次。

9、晾干后加入20ul双蒸水，溶解DNA。

按照表2配置PCR反应体系。

表2 PCR反应体系

PCR反应程序如下：

第一步:PCR仪上盖预热104℃；

第二步:94℃预变性3min；

第四步:72℃延伸4min。

扩增产物的PAGE胶检测

将SSR17和SSR75位点的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后的凝胶进行EB染色，在凝胶成像系统下进行拍照。

SSR17、SSR75和SSR80位点的扩增产物的扩增情况如图1所示。从图1中可以看出，SSR17、SSR75和SSR80扩增位点能够得到清晰的条带，说明上述3对引物具有较好的特异性。

实施例2

按照实施例1的方法对夏抗40天父母亲本的DNA进行SSR17位点的PCR扩增。

将扩增得到夏抗40天的SSR17扩增产物和夏抗40天父母亲本的DNA进行SSR17位点的扩增产物进行PAGE凝胶电泳。

PAGE胶对扩增产物的检测是将琼脂糖凝胶电泳初步筛选出的引物对红萝卜基因组DNA进行扩增，并将PCR扩增产物中的(夏抗40天父本,夏抗40天母本，夏抗40天)扩增产物中，均添加5ul上样缓冲液,用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶。电泳仪的设置参数一般是电压1200～1500V，电流60mA～80mA的功率下电泳1.5小时。电泳槽内缓冲液一般为0.5×TBE或者1×TBE。电泳结束后,取下胶板进行银染显色。具体操作流程如下:

(1)玻璃板清洗:用清洁剂将玻璃板两面反复清洗擦拭干净,用清水和纯水清洗(up水)清洗后，长板和短板处理如下,

长板:先用无水酒精2ml擦净晾干，放室温,反硅化处理，无水酒精2ml+反硅化剂(亲和硅烷)10ul+冰乙酸10ul,滤纸涂匀晾干

短板:先用无水酒精2ml擦净晾干，放室温，硅化处理，剥离硅烷2ml。滤纸涂匀晾干。

(2)制胶和灌胶:1.0mm板取60mlPAGE(1.5mm板取80ml)储存液，加420ul 10％AP和42ul TEMD溶液,摇匀后导入板子间隙(注意不要有气泡进入)，将梳子倒置，使无孔的一方插入胶板中。然后，将胶板水平放置15min左右，待你凝固(在室温20℃左右时)。

(3)电泳:将凝固好的玻璃板放置在电泳槽后，在上下槽中分别添加适量0.5×TBE缓冲液，预电泳10min后，暂停电泳。然后在梳齿空内加入DNA扩增样4.5ul。

(4)银染:电泳结束后，在装有染色液的盆中加入3ml甲醛混匀，然后将胶板短板移除，将带有胶的长坂放入到染色液中，摇床60-70摇5min(新配银染液染色5min，用过5到6次后，染色10min)。银染液制备:3g AgNO₃+2L ddH₂O(可用8～10次)

(5)漂洗:将长胶板从银染液中取出,然后用纯水清洗2～3次，转入到显色液中。

(6)显色:加入2LNaOH溶液中，显色约5min左右，加3ml甲醛(摇床60～80min左右)。色液制备:30g NaOH，2L ddH₂O，用之前加热(约50℃)效果较好。(可1L ddH₂O加热至100度左右，另加1L ddH₂O，配NaOH，二者混合)。停止显色后用纯水清洗干净。

(7)照相:显色结束后，将胶放在白色背景下，照相保存，并读取记录显色条带。

SSR17扩增产物的PAGE凝胶电泳图见图2。从图2中可以看出，夏抗40天父本和夏抗40天母本的条带大小不相同，说明存在等位基因，夏抗40天扩增的条带有两条，并且得到的两条条带分别与父本和母本的条带相同，说明夏抗40天萝卜品种的SSR17位点具有共显性。

实施例3

按照实施例1的方法对夏抗40天父母亲本的DNA进行SSR75位点的PCR扩增。

将实施例1中扩增得到夏抗40天的SSR75扩增产物和夏抗40天父母亲本的DNA SSR75扩增产物进行PAGE凝胶电泳。所述PAGE凝胶电泳步骤同实施例2，在此不做赘述。

SSR75扩增产物的PAGE凝胶电泳图见图3。从图3中可以看出，夏抗40天父本和夏抗40天母本的条带大小不相同，说明存在等位基因，夏抗40天扩增的条带有两条，并且得到的两条条带分别与父本和母本的条带相同，说明夏抗40天萝卜品种的SSR75位点具有共显性。

实施例4

对商品夏抗40天萝卜品种进行纯度鉴定，鉴定方法如下：

按照实施例1的方法对夏抗40天子一代进行DNA提取。将商品夏抗40天萝卜品种和父本、母本和夏抗40天采用实施例1的PCR方法进行扩增SSR17位点，采用实施例2的方法进行PAGE凝胶电泳，得到的PAGE凝胶电泳图如图5所示。

由图4可以看出，通过以父本、母本和夏抗40天的带型作为参照，将待检测的子一代群体中每一个体的电泳带型是否与夏抗40天的带型是否一致，与夏抗40天的带型一致的则表明为子一代真杂合体，否则为非子一体真杂合体，根据计算，子一代中真杂合体纯度达到92％。

实施例5

对商品夏抗40天萝卜品种进行纯度鉴定，鉴定方法如下：

按照实施例1的方法对夏抗40天子一代进行DNA提取。将商品夏抗40天萝卜品种和父本、母本和夏抗40天采用实施例1的PCR方法进行扩增SSR75位点，采用实施例2的方法进行PAGE凝胶电泳，得到的PAGE凝胶电泳图如图5所示。

由图5可以看出，通过以父本、母本和夏抗40天的带型作为参照，将待检测的子一代的电泳带型是否与夏抗40天的带型是否一致，与夏抗40天的带型一致的则表明子一代为杂合种，否则为纯种；根据计算，子一代中纯度达到95％。

实施例6

夏抗40品种在田间种植后采用人工观察形态指标及称量亩产等指标，田间表现如图6，并对萝卜的根、叶等重要植物学性状进行观察和统计分析，结果如表3。从根形上看，夏抗40天萝卜为长圆柱形，叶形为板叶。结合叶形和根形表现，统计发现夏抗40天萝卜田间纯度可达92.21±2.35％(M±SD)。

表3夏抗40天植物学性状

由以上实施例可知，本发明提供了耐热萝卜EST-SSR分子标记，为SSR17或SSR75。本发明通过对耐热萝卜品种--夏抗40天筛选得到2个EST-SSR分子标记，并且所述SSR17和SSR75具有共显性表达特性，利用具有共显性关系的2个EST-SSR分子标记对商品种耐热萝卜品种--夏抗40天的群体纯度进行检测，结果显示其纯度高达92％以上，同田间表型一致，因此，所述2个 EST-SSR分子标记能够用于耐热萝卜品种的纯度检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 黄冈师范学院

<120> 耐热萝卜EST-SSR分子标记及其应用

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaagcagatg attgcaaaac cttaagccat tctaacaaaa gaaaacttgc agaagacatt 60

gatgatacag catcaccacc accaccatca tcatcatcat catcatcatc aagttctgat 120

gattcttctg tcgaggactt tccatcttca aaacggatg 159

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggggagtta gtgggaagaa gaggaatgta gcagcagcag cacatggtgg tggtgggaag 60

aaaaaggatt gtgatgatga aaagttggtg ttttttgatg atcaagtggt gaaggagaag 120

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tcaaataatg agagagctgt ggctagtggt ggtggtggtg gtggtgatgg agagcctttc 240

cttgtgacga 250

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaagcagatg attgcaaaac c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catccgtttt gaagatggaa a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggggagtta gtgggaagaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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