柏树微卫星分子标记组合、引物筛选方法及其应用与流程

本发明涉及林业分子生物
技术领域：
，具体涉及柏树分子标记技术，更具体涉及一种柏树微卫星分子标记及其筛选方法和在鉴定柏树亲源关系及品种鉴定和辅助育种中等领域的应用。
背景技术：
：柏科植物很多种类是主要的木材原料，并且被广泛地应用于园艺、医药等领域。柏树全身是宝，树脂、树油、果实、枝节、树叶均能入药使用。而以侧柏的种子柏子仁和侧柏叶在临床上应用得最为广泛。种仁：甘，平，可养心安神，止汗，润肠。枝梢及叶：苦涩，微寒凉血止血，生发乌发，可治吐血、痢疾、痔疮、烫伤等症。中国传统中医学认为，柏树发出的芳香气体具有清热解毒、燥湿杀虫的作用，可祛病抗邪，培养人体正气。据测试，其主要成分为菘萜、柠檬萜。这些天然物质不仅能杀灭细菌、病毒，净化空气，而且具有松弛精神、稳定情绪的作用。人们吸入柏树的香味后，可使血压下降，大脑血流量减少，抑郁情绪得到缓解。柏树的根、杆、疙头都合有挥发油，名曰柏木油(cedarwoodoil)或柏香油。柏木原油经减压蒸馏而得柏木精油，出口一般叫b、p、c柏木精油，它的主要成分是柏木醇(柏木脑)、柏木烯和少量的萜烯类化合物。柏木精油广泛应用于香料、医药和国防工业的原料。柏科种植资源丰富，是分布最广的针叶植物，除了南极洲以外世界各地都有它的分布，包括27个属(其中有17个单型属)大约有142个种。长期的自然进化和选择过程，产生了丰富的遗传变异资源，又称种植资源。种质资源的准确区分与鉴定是进行良种选育和遗传改良的基础。但是关于柏科资源分布、种群遗传多样性和种质资源保护等方面的研究尚未见报道，对于柏科植物的种质资源鉴定、分子辅助选育等方面研究尚属空白。微卫星有助于鉴定柏树品系，并区分出伪品。同时，利用微卫星标记对柏树分子育种的研究尚且很少，其中一个重要的限制因素就是分子标记技术的缺乏，尤其是柏科的基因组巨大而复杂，低成本、高通量的分子标记技术的建立对于柏科遗传鉴定、分子辅助选育有重要价值。微卫星(microsatellite)又称作短串连重复(shorttandemrepeats，strs)、简单重复序列(simplesequencerepeat，ssrs)、简单序列长度多态性(sslp)。是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列，一般为1～6bps)为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的，但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列，与其它标记技术相比，具有以下特点：首先，在每个微卫星dna两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，尤其在亲缘关系相近的物种间是保守的，而且在一些紧密相关的物种中其重复单位和重复次数具有一定的相似性。其次，这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其它未知的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上的差异。微卫星的突变率高：每代每个配子的每个位点有25每个配子的～15每个配子突变，因此造成了它们的多态性。微卫星寡聚核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大。微卫星通常是复等位的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。微卫星dna的多态性比rflp显著增高据此设计引物，即可通过pcr技术分析核心序列重复次数的变异，在不同的遗传型间检测到多态。根据重复单元的构成，微卫星dna序列被分为3种类型：单一型(pure)，复合型(compound)和间断型(interrupted)作为一种分子标记，微卫星dna具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中，据估计每6到10kb长度中就有1个微卫星位点；核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，多态性信息容量高：呈共显性，遵循盂德尔法则遗传；选择中性等等。微卫星标记具有较高的等位基因多样性和共显性的特点，且其具有数量多、研究成本较低、操作较方便、重复性高等优点，使其成为广泛被使用的分子标记之一。基于以上特点，微卫星dna被广泛开发用于植物遗传连锁图谱的构建、基因定位、品种鉴定和种质保存、数量性状基因的分析、分子标记辅助育种、构建指纹图谱、遗传多样性及物种进化与亲缘关系等方面的研究。由于植物细胞除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传。细胞器基因组具有非重组性和单亲遗传等特点，所以被广泛地应用于研究植物生态学和遗传进化的研究。在植物中，线粒体基因组差异较大，分子内重组水平较高，在其广泛应用中有很大的困难；而叶绿体基因组特点(1)分子量小，多拷贝，结构简单，多为闭环双联dna，大小为120～210kb；(2)原核性，序列相当保守，进化速率缓慢，仅为ndna的1/5，在较多植物类群有不同程度种内变异：(1)单亲遗传，不参加基因重组(不受选择压力)，切不收基因的重叠、缺失及假基因的干扰，有独立的进化路线，不依赖其他任何数据可建立分子系统树，查明植物进化历史。这些特点有利于对其进行分析，包括物理图谱的构建和特定基因的分离、鉴定和序列测定)，适合用于具有较高分类单位的系统演化研究，在植物的种间、属间和科间在系统发育方面比ndna和线粒体mdna有更加广泛的应用性。对cpdna进行分析科从历史和系统发育的角度解释生物多样性可靠和准确的信息。在柏科上大多数物种的叶绿体基因组是父系遗传的，叶绿体微卫星标记可用于直接检测花粉流，其通用性会较强，所以叶绿体微卫星标记可以应用于柏树种间和种内的遗传多态性检测。因此，开发柏树叶绿体多态性微卫星分子标记的应用，对进行柏树生态群体遗传结构多样性分析、基因流动、进化、物种演化、胞质遗传特性、种群分类、亲缘关系谱系构建、品种鉴定、辅助选育、和种质资源保护具有重要意义。而现有技术中目前在柏树方面的分子标记开发还比较少，并未记载有针对柏树的细胞核dna外的其他物质用于鉴定柏树的种质资源，无法满足当前柏树遗传学研究和育种研究的生产和科研要求。柏科植物的基因组较为复杂并且巨大，所以要开发出一些有效的分子标记并非易事。分子标记的种类很多，但是有些分子标记操作比较麻烦，而且成本比较高，且标记的效果也参差不齐，稳定高效的分子标记是较为需要得到的。柏树的大规模商业化应用为我们提出了我们开发高效、操作简单，检测精确性高、稳定高效的辅助选育手段为以后的利用做好基础性研究工作的重要任务。技术实现要素：为了解决现有技术中鉴定柏树种质资源有效手段缺乏的问题，本发明的目的是提供一组在柏树可以直接应用于种内和种间，具有很好的通用性和实用性的高效、操作简单，检测精确性高、稳定高效的叶绿体多态性微卫星分子标记、其筛选方法和扩增引物、品种鉴定方法和亲源关系鉴定的方法。一方面，本发明提供了一种柏树多态性微卫星分子标记的组合，其中，该柏树微卫星多态性分子标记的组合选自编号为n1、n2、n4、n6、n8、n9、n10、n11、n13、n14、n15、n16、n18、n19、n20、n22、n23、n25、n27、n28、n29、n31、n32、n33、n34、n35，核苷酸序列分别如seqno.1～seqno.26所示。26个通用型柏树微卫星分子标记的组合的部分组合或全部组合本发明的微卫星多态性分子标记的组合，其中，柏树多态性微卫星分子标记的组合是根据从核苷酸序列分别如seqno.1～seqno.26所示的各编号的26个通用型柏树微卫星分子标记筛选获得的遗传多态性指标得分较高的的分子标记的组合，柏树多态性微卫星分子标记组合中的分子标记数量为4～10个，或者可优选的，柏树多态性微卫星分子标记组合中的分子标记数量为6～8个，所述遗传多态性指标包括等位基因数(numberofalleles，na)、有效等位基因数(effectivenumberofalleles，ne)、香农-威纳指数(shannon-wienerindex，i)、多态性(diversity，h)、无偏差多态性(unbiaseddiversity，uh)微卫星多态性分子标记的组合选自编号为n2，n6，n8，n11，n13，n16，n19.n27的柏体微卫星分子标记中的4～8对。在本发明的柏树微卫星多态性分子标记的组合中，编号为n1的微卫星分子标记的重复序列为(ac)6，所述编号为n2的微卫星分子标记的重复序列为(at)5，所述编号为n4的微卫星分子标记的重复序列为(aaggacaaa)5，所述编号为n6的微卫星分子标记的重复序列为(ta)5，所述编号为n8的微卫星分子标记的重复序列为(at)6，所述编号为n9的微卫星分子标记的重复序列为(ta)12，所述编号为n10的微卫星分子标记的重复序列为(ca)5，所述编号为n11的微卫星分子标记的重复序列为(at)6，所述编号为n13的微卫星分子标记的重复序列为(at)5，所述编号为n14的微卫星分子标记的重复序列为(at)6，所述编号为n15的微卫星分子标记的重复序列为(at)6，所述编号为n16的微卫星分子标记的重复序列为(at)5，所述编号为n18的微卫星分子标记的重复序列为(ac)6，所述编号为n19的微卫星分子标记的重复序列为(aga)6，所述编号为n20的微卫星分子标记的重复序列为(at)5，所述编号为n22的微卫星分子标记的重复序列为(ca)5，所述编号为n23的微卫星分子标记的重复序列为(at)6，所述编号为n25的微卫星分子标记的重复序列为(ta)5，所述编号为n27的微卫星分子标记的重复序列为(at)7，所述编号为n28的微卫星分子标记的重复序列为(at)7，所述编号为n29的微卫星分子标记的重复序列为(ta)5，所述编号为n31的微卫星分子标记的重复序列为(at)5，所述编号为n32的微卫星分子标记的重复序列为(at)5，所述编号为n33的微卫星分子标记的重复序列为(tct)5，所述编号为n34的微卫星分子标记的重复序列为(tct)5，所述编号为n35的微卫星分子标记的重复序列为(at)6。在本发明的柏树微卫星多态性分子标记的组合中，通用型柏树微卫星分子标记的为叶绿体微卫星分子标记。在本发明的柏树微卫星多态性分子标记的组合中，编号分别为n1、n2、n4、n6、n8、n9、n10、n11、n13、、n15、n16、n18、n19、n20、n22、n23、n25、n27、n28、n29、n31、n32、n33的26个通用型柏树微卫星分子标记的引物对序列为：n1的正向引物为ttctagctcgcacccaaact，反向引物为ttgtttcgccgatatgttca；n2的正向引物为tggtcataccattgctgttca，反向引物为tgggctactctacgtgcttt；n4正向引物为tcggaagaagaagatgatatgtagc，反向引物为ccccagatatggaacttttgg；n6正向引物为gggaacaaccagaattggaa，反向引物为gccacttttatggcacgact；n8正向引物为gggaagcggaaagctatttt，反向引物为ggtaatccacagcagccaat；n9正向引物为caaatttctcgccaagctgt，反向引物为tgatttcatcgggtcgaata；n10正向引物为tcgggaacgaaagagaaaga，反向引物为acatagatgttatggagcagagc；n11正向引物为tccaatctagaacatctcatccag，反向引物为cagtgctctacctaatctgaaagc；n13正向引物为tcgccgcaatactcctaatc，反向引物为attccgaaaagatggcttca；n14正向引物为tccatatctggtggacagga，反向引物为gggttttggtcttcttcttcg；n15正向引物为ccaggtcgagacaagtggat，反向引物为gaaaccaatgccctaagcaa；n16正向引物为attcgatccctatccggtct，反向引物为accagagccatcaaccactc；n18正向引物为aaaatcgccgcaatactcct，反向引物为attccgaaaagatggcttca；n19正向引物为cggacctaccgacagaactc，反向引物为ccgaagaaataagaagctgtatagg；n20正向引物为cttgctcctagccatgaaaa，反向引物为tgatttcatcgggtcgaatag；n22正向引物为ctgtgatgccgttgatattga，反向引物为tgcccattatccctctgttc；n23正向引物为tcctctgcgatcttttataggg，反向引物为gggaaggattgttggattga；n25正向引物为cctcatacggcttctcgttc，反向引物为aaaatgaaccccgaaggatt；n27正向引物为tgatttcatcgggtcgaata，反向引物为caaatttctcgccaagctgt；n28正向引物为gagatgaacgcagagcgtaa，反向引物为tgtttgagcgattcctaccc；n29正向引物为gccatggtaaggcgtaagtc，反向引物为tcagtcaatgggttaggttca；n31正向引物为gtagccaagtggttccaagg，反向引物为caatcttaccgtcgattcagc；n32正向引物为ggacgggaaaggaaaagaa，反向引物为tggtattcttctgggttttgg；n33正向引物为ctgttcccctgtgcatcata，反向引物为aggaggaaaatccgttggtt；n34正向引物为tcagtcaatgggttaggttca，反向引物为gccatggtaaggcgtaagtc；n35正向引物为tgtttgagcgattcctaccc，反向引物为gagatgaacgcagagcgtaa。第二方面，本发明提供了在本发明第一方面的柏树多态性微卫星分子标记的组合的引物对组合，这些引物对组合为从编号为n1、n2、n4、n6、n8、n9、n10、n11、n13、n14、n15、n16、n18、n19、n20、n22、n23、n25、n27、n28、n29、n31、n32、n33、n34、n35的26个通用型柏树微卫星分子标记序列的对应引物对中选出的可扩增得到遗传多态性指标得分较高的ssr序列的引物对，所述多态性柏树微卫星分子标记的组合的引物对的数量为4～10对引物，或者可优选的，所述多态性分子标记组合的引物对的对数的数量为6～8对引物。本发明的多态性微卫星分子标记的组合的引物对组合中，编号为n2，n6，n8，n11，n13，n16，n19和n27的柏树叶绿体微卫星分子标记的引物对在侧柏中具有最高的多态性统计值。第三方面，本发明提供了多态性微卫星分子标记的组合的引物对组合的应用，多态性引物的部分组合或全部组合可用于研究柏树的遗传多样性、基因流动、种间变异、亲缘关系、物种进化演化、种群分类、品种鉴定、辅助选育及种质资源保护。在本发明的柏树叶绿体多态性微卫星分子标记的组合、引物对组合及应用中，柏树包括侧柏(platycladusorientalis)、藏柏(cupressustorulosa)、圆柏(sabinachinensis)和刺柏(juniperusformosana)。在本发明的通用型柏树微卫星分子标记的组合的引物中，上述柏树多态性微卫星分子标记中的引物对组合可用于作为研究柏树的群体遗传结构多样性、基因流动、种间变异、亲缘关系谱系构建、物种演化、种群分类、品种鉴定、辅助选育、和种质资源保护的的工具。第四方面，本发明提供了一种筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法。本发明的一种筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法包括步骤：首先分析genbank公布的柏树叶绿体基因组全序列，筛选微卫星分子标记，然后根据微卫星标记重复序列两端的侧翼序列设计引物；最后通过分析微卫星分析标记pcr扩增产物的多态性筛选多态性引物。本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法中，柏树包括(cupressusgigantean)、地中海柏木(cupressussempervirens)、北美樱桃圆柏(juniperusmonosperma)、百慕大桧(juniperusbermudiana)、落基山圆柏(juniperusscopulorum)和北美圆柏(juniperusvirginiana)；柏树叶绿体基因组全序列的分析采用gmata2.1软件。本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法中，柏树微卫星分子标记的筛选条件为重复次数大于5，重复片段长度在2～10bp之间，总长度小于等于2000bp。本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法中，柏树微卫星分子标记的引物设计参数为引物长度18～22bp，以20bp为最佳；引物退火温度(tm值)在58～62℃之间，以60℃为最佳，上游和下游的引物退火温度之差1～5℃；鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率(gc含量)为40％～70％预期pcr产物长度为120～400bp。本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法中，柏树微卫星分子标记的引物设计参数为引物长度优选20bp；引物退火温度(tm值)优选60℃为最佳，上游和下游的引物退火温度之差在2℃以内；鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率(gc含量)为50％～60％；预期pcr产物长度优选为200～300bp。本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法中，多态性引物的筛选包括初步筛选和复筛，初步筛选是利用琼脂糖凝胶电泳初步分析微卫星分子标记pcr扩增产物的多态性，筛选扩增良好的引物，复筛是利用毛细管电泳分析确定微卫星分子标记pcr扩增产物的多态性，复筛多态性引物。本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法中，多态性引物的初步筛选包括步骤：(1)4个柏树品种不同个体柏树的叶绿体dna，提取的柏树品种包括侧柏(platycladusorientalis)、藏柏(cupressustorulosa)、圆柏(sabinachinensis)和刺柏(juniperusformosana)；(2)琼脂糖凝胶电泳鉴定步骤(1)所得同一品种柏树的叶绿体dna的纯度和完整性；(3)以步骤(2)选出的高纯度dna为模板，进行pcr扩增。pcr扩增的引物为本发明第一方面的通用型柏树叶绿体微卫星分子标记的n1～n26的引物对。pcr扩增的反应体系为：2×taqpcr预混液，10μl(含4nmoldntp；0.5utaqdna聚合酶)；模板dna，2.0μl(20ng)；1μm/l正向引物0.82μl；1μm/l反向引3.2μl；ddh2o，0.82μl；用pcr纯等级水补足至20μl；pcr扩增程序为：94℃，预变性5min；94℃，变性30s，50～59℃，退火30s，72℃，延伸40s，35个循环；72℃，延伸5min；4℃保存；本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法中，柏树叶绿体多态性微卫星分子标记的复筛包括步骤：(1)提取侧柏(platycladusorientalis)、藏柏(cupressustorulosa)、圆柏(sabinachinensis)和刺柏(juniperusformosana)四个品种不同个体的柏树叶绿体dna；(2)检测步骤(1)所得的同一品种柏树的叶绿体dna的纯度和完整性；(3)三引物法荧光pcr扩增26个柏树叶绿体微卫星分子标记；扩增将26对引物的正向引物的5’端加上m13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型m13引物，以步骤(2)高纯度dna为模板进行三引物法pcr扩增；通用型m13引物序列为tgtaaaacgacggccagt；(4)毛细管电泳检测，读取原始数据，统计分析等位基因数(numberofalleles，na)、有效等位基因数(effectivenumberofalleles，ne)、香农-威纳指数(shannon-wienerindex，i)、多态性(diversity，h)、无偏差多态性(unbiaseddiversity，uh)。复筛荧光pcr扩增的反应体系为：2×taqpcr预混溶液10μl(含4nmoldntp和0.5utaqdna聚合酶)；模版dna2μl(50ng)；1μm/l正向引物0.8μl；1μm/l反向引物3.2μl；1μm/lm13引物，3.2μl；ddh2o0.8μl，用pcr纯等级水补足至20μl；复筛荧光pcr扩增的反应程序为：94℃，预变性4min；94℃，变性30s，60℃，退火30s(每循环降低0.5℃)，72℃，延伸45s，共20循环；94℃，变性30s，50℃，退火30s，72℃，延伸45s，共20循环；72℃，延伸10min；4℃保存；本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法的柏树叶绿体多态性微卫星分子标记的复筛中，读取原始数采用genemarkerv2.4.0软件，统计分析采用genealex软件。本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法的柏树叶绿体多态性微卫星分子标记的复筛中，选取毛细管电泳分析结果为(具有稳定多态性的引物扩增得到的)的柏树叶绿体微卫星分子标记，即为柏树叶绿体多态性微卫星分子标记。本发明的筛选柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的方法中，荧光标记选自fam、hex、tamra或rox中的一种。本发明的柏树叶绿体多态性微卫星分子标记筛选方法中，步骤(7)的多态性遗传数据分析方法为：采用genemarkerv2.4.0软件进行数据分析。本发明的柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的筛选方法中，中，统计分析的多态性遗传数据的包括：等位基因数(numberofalleles，na)、有效等位基因数(effectivenumberofalleles，ne)、香农-威纳指数(shannon-wienerindex，i)、多态性(diversity，h)、无偏差多态性(unbiaseddiversity，uh)；本发明的柏树叶绿体多态性微卫星分子标记引物组合的筛选方法中，读取原始数据采用genemarkerv2.4.0软件，统计分析采用genealex软件。用柏树pcr扩增产物的毛细管电泳数据经genealex导出数据文件，用populations-1.2.32算的矩阵，再用splitstree4.14.2算出的树的表示公式，最后用figtreev1.4.2完成做系统进化树图。可以根据个体分开的程度，和树枝端出现并列的个体标号的多少和个体间隔的节点，判断供试柏树品种亲缘关系的远近。因此使用了这些分子标记较有效地得出个体间的亲缘关系并且可用于遗传多样性的研究。本发明的优点在于，提供了个柏树品种的26个通用的叶绿体微卫星位点的组合及扩增该26个柏树叶绿体多态性微卫星标记组合的引物对序列及多态性叶绿体微卫星标记引物的筛选方法和应用，建立了柏树的叶绿体微卫星dna分子标记扩增技术体系，并利用这些柏树叶绿体多态性微卫星位点进行柏树遗传多样性分析、指纹图谱构建和分子标记辅助育种，重复性好，这些标记可以直接应用于种内和种间，具有很好的通用性和实用性，是一种可靠有效的dna分子标记。由于叶绿体是植物细胞质中特有的细胞器，故而叶绿体基因组的序列变异有助于植物细胞质基因型的区分开，针对柏树叶绿体基因组上的dna序列筛选出来的叶绿体微卫星分子标记，该叶绿体微卫星分子标记具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高度变异和多态性等特点，此外，柏树的叶绿体为母性遗传，母性遗传使叶绿体的dna具有单亲遗传模式、且不易发生重组的特点，同时使得叶绿体微卫星分子标记具有结构简单、多拷贝以及分子量小等特点，同时，叶绿体微卫星分子标记主要位于叶绿体基因组的非编码区，而叶绿体dna的非编码区序列在种内或种群间也存在遗传变异，使得该柏树叶绿体微卫星分子标记的多态性引物能够全面地反映柏树的遗传信息，使得本发明提供的鉴定柏树遗传多样性的方法能够准确、全面地反应柏树的遗传多样性，同时，也能够使得发明提供的鉴定柏树遗传多样性和亲缘关系的方法能够更全面。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例一提供的的26对通用型柏树叶绿体微卫星分子标记的引物对在24份侧柏个体混合样品中初筛扩增产物的电泳图谱图谱。图1.编号为n1，n2，n4，n6，n8，n9，n10，n11的通用型微卫星分子标记的引物在侧柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n1的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n2的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n4的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n6的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n8的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n9的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n10的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n11的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n11的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n12的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；图2.编号为n13，n14，n15，n16，n18，n19，n20，n22的通用型微卫星分子标记的引物在24份侧柏个体混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n13的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n14的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n15的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n16的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n18的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n19的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n20的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n22的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；图3.编号为n23，n25，n27，n28，n29，n31，n32，n31，n33的通用型微卫星分子标记的引物24份侧柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n23的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n25的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n27的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n28的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n29的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n31的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n32的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n33的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果；图4.编号为n34，n35的通用型微卫星分子标记的引物在24份侧柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n33的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n34的微卫星标记的引物在侧柏混合样品模板的pcr扩增结果。图5.编号为n1，n2，n4，n6，n8，n9，n10，n11的通用型微卫星分子标记的引物在24份圆柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果。泳道1和2为编号为n1的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道3和4为编号为n2的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n4的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n6的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n8的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n9的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n10的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n11的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；图6.编号为n13，n14，n15，n16，n18，n19，n20，n22的通用型微卫星分子标记的引物在24份圆柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n13的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n14的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n15的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n16的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n18的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n19的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n20的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n22的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；图7.编号为n23，n25，n27，n28，n29，n31，n32，n31，n33的通用型微卫星分子标记的引物在24份圆柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果。泳道1和2为编号为n23的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n25的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n27的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n28的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n29的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n31的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n32的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n33的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果；图8.编号为n34，n35的通用型微卫星分子标记的引物在24份圆柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n33的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n34的微卫星标记的引物在圆柏混合样品模板的pcr扩增结果。图9.编号为n1，n2，n4，n6，n8，n9，n10，n11的通用型微卫星分子标记的引物在24份刺柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n1的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n2的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n4的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n6的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n8的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n9的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n10的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n11的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；图10编号为n13，n14，n15，n16，n18，n19，n20，n22的通用型微卫星分子标记的引物在24份刺柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n13的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n14的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n15的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n16的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n18的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n19的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n20的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n22的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；图11.编号为n23，n25，n27，n28，n29，n31，n32，n33的通用型微卫星分子标记的引物在24份刺柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n23的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n25的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n27的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n28的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n29的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n31的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n32的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n33的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；图12编号为n34，n35的通用型微卫星分子标记的引物在24份刺柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果.泳道1和2为编号为n34的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道3和4为编号为n35的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；图13.编号为n1，n2，n4，n6，n8，n9，n10，n11的通用型微卫星分子标记引物在24份藏柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果。泳道1和2为编号为n1的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n2的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n4的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n6的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n8的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n9的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n10的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n11的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；图14.编号为n13，n14，n15，n16，n18，n19，n20，n22的引物在24份藏柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n13的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n14的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n15的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n16的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n18的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n19的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道13和14为编号为n20的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道15和16为编号为n22的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；图15.编号为n23，n25，n27，n28，n29，n31，n32，n31，n33的引物在24份藏柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果。泳道1和2为编号为n23的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果，泳道3和4为编号为n25的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道5和6为编号为n27的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道7和8为编号为n28的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道9和10为编号为n29的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道11和12为编号为n31的微卫星标记的引物在藏柏混合样品模板的pcr扩增结果；图16.编号为n34，n35的引物在24份藏柏个体叶片混合样品模板中的pcr扩增结果泳道1和2为编号为n34的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；泳道3和4为编号为n35的微卫星标记的引物在刺柏混合样品模板的pcr扩增结果；附图1～16中，泳道m代表marker(型号d2000，购自北京天根生物技术公司)图17.192个个体的毛细管电泳数据经genealex导出数据文件制作的系统进化树。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案、实际应用更加清楚，下面结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。实施例一一种柏树叶绿体微卫星分子标记的多态性引物的筛选方法1.叶绿体微卫星分子标记的筛选从genbank公共数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载以下6种柏树的叶绿体基因组全序列：巨柏(cupressusgigantean)、地中海柏木(cupressussempervirens)、北美樱桃圆柏(juniperusmonosperma)、百慕大桧(juniperusbermudiana)、落基山圆柏(juniperusscopulorum)和北美圆柏(juniperusvirginiana)，利用gmata2.1软件分析上述6种柏树的叶绿体基因组全序列，筛选微卫星分子标记，即ssr位点，筛选条件为重复数大于5，重复片段长度在2bp～10bp之间，总长度小于等于2000bp(ssr+侧翼序列总长度小于等于2000bp)。筛选得到26个ssr位点，编号为n1、n2、n4、n6、n8、n9、n10、n11、n13、n14、n15、n16、n18、n19、n20、n22、n23、n25、n27、n28、n29、n31、n32、n33、n34、n35，各编号ssr位点核苷酸序列分别如seqno.1～seqno.26所示，详细信息如表1所示，。表1.叶绿体基因组全序列分析选出的ssr位点详情注：ir表示两个基因间的区域2.叶绿体微卫星分子标记的引物设计利用primer3.0软件分析步骤1所得的26个微卫星分子标记的侧翼序列，设计上下游引物，引物设计的主要参数如下：引物长度18～22bp，以20bp为最佳；引物退火温度(tm值)在58～62℃之间，以60℃为最佳，上游和下游的引物退火温度之差在5℃以内；鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率(gc含量)为40％～70％，最适gc含量为50％；预期pcr产物长度为120～400bp。设计出的引物如表2所示，引物由睿博兴科合成。表2.26个柏树叶绿微卫星位点的引物对的核苷酸序列及退火温度3.柏树叶绿体多态性微卫星标记引物的初步筛选混合样品的准备：其中侧柏叶片混合样品由来自24个侧柏个体的(编号为c1～c24)侧柏叶片混合而成；藏柏叶片混合样品由来自8个藏柏个体(编号为z1～z8)的藏柏叶片混合而成；圆柏叶片混合样品由来自8个圆柏个体(编号为y1～y8)的圆柏叶片混合而成；刺柏叶片混合样品由8来自8个刺柏个体(编号为ci1～ci8)的刺柏叶片。3.1提取混合样品的叶绿体dna侧柏叶绿体dna的提取①采用改良的ctab法提取侧柏叶片四种混合样品的叶绿体dna。②取50mlctab提取液(含5mmctab，100mmtris-hcl，20mmedta，140mmnacl，ph8.0)放入65℃水浴锅中预热待用。③取侧柏叶片混合样品0.5g，放入研钵中，加入少量pvp-40，在液氮中迅速研磨成粉末状，转移至装有65℃预热的ctab提取液(用前按体积比10∶1加入2％β-巯基乙醇混匀)的1ml离心管(用前做灭菌处理)中。④旋涡剧烈振荡，充分混匀，放入65℃水浴锅中，水浴50min，每隔10min上下翻动离心管使提取物充分混匀，水浴结束后12000rpm常温离心10min。⑤取上清液于新的离心管中(注意吸取时不要触及分界面，以免带入杂质)，加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液(25∶24∶1)(现用现配)，轻轻颠倒混匀，室温放置10min，之后12000rpm常温离心10min。⑥取步骤⑤所得上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)再次抽提。⑦步骤⑥所得上清液于新的离心管中，加等体积-20℃遇冷的异丙醇沉淀dna，轻轻颠倒混匀，置于-20℃冰箱中沉淀30min。⑧挑出dna絮状沉淀到置1.5ml离心管中，用70％乙醇清洗沉淀2次，每次30min。⑨在超净工作台中用无菌风吹干沉淀，加入100μlte缓冲液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph＝8.0)溶解dna，于-20℃保存待用。同法操作提取藏柏、圆柏、刺柏叶片混合样品的叶绿体dna。3.2检测dna的纯度及完整性侧柏个体混合样品叶绿体dna的纯度及完整性检测：①分别取3μl步骤3.1所得的c1～c24个体混合样品的叶绿体dna、z1～z8个体混合样品的叶绿体dna、y1～y8个体混合样品的叶绿体dna、ci01～ci08个体混合样品的叶绿体dna样品液，在超微量紫外分光光度计上测量其dna含量(μg/ml)、a260nm/a280nm的值及其在260nm处的吸收峰，检测dna的纯度。选取a260nm/a280nm的值在1.9左右及其在260nm处＞0.1的吸收峰为纯度满足要求的dna②分别取5μl步骤3.1所得dna样品液混合1μl6×上样缓冲液(30mmedta；36％(v/v)丙三醇；0.05％(w/v)二甲苯青ff；0.05％(w/v)溴酚蓝)，在浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳中检测dna的完整性。选取电泳图中无拖带的编号的柏树叶绿体微卫星分子标记为完整dna，分别为(根据电泳图填写)同法操作检测藏柏、圆柏、刺柏叶绿体dna样品液的纯度及dna的完整性。3.3初步筛选pcr扩增(1)分别以高纯度侧柏、藏柏、圆柏、刺柏叶绿体dna为模板进行pcr扩增，每个标号的柏树叶绿体微卫星分子标记的pcr扩增反应体系如下：2×taqpcr预混液，10μl(含4nmoldntp；0.5utaqdna聚合酶)；模板dna，2.0μl(20ng)；1μm/l正向引物0.82μl；1μm/l反向引3.2μl；ddh2o，0.82μl；用pcr纯等级水补足至20μl；(2)pcr扩增程序如下：94℃，预变性5min；94℃，变性30s，50～59℃，退火30s，72℃，延伸40s，35个循环；72℃，延伸5min；4℃保存。(2)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物编号为n1、n2、n4、n8、n9、n10、n11、n13、n15、n16、n18、n20、n22、n23、n25、n27、n29、n31、n32、n33、n34、n35的叶绿体微卫星分子标记的引物对分别在侧柏、藏柏、圆柏、刺柏叶片混合样品的扩增产物电泳结果如图1至图16所示。由图1到图4可看出，在侧柏样品叶片混合物模板中，采用编号为n1、n2、n4、n8、n9、n10、n11、n13、n15、n16、n18、n20、n22、n23、n25、n27、n29、n31、n32、n33、n34、n35的叶绿体微卫星分子标记的引物对扩增得到目的基因产物，编号为n6，n14，n19和n28叶绿体微卫星分子标记的引物未扩增得到目的基因产物。在圆柏样品叶片混合物中，n1、n2、n4、n8、n9、n10、n11、n13、n15、n16、n18、n20、n22、n23、n25、n27、n29、n31、n32、n33、n34、n35、n6，n14，n19和n28的叶绿体微卫星分子标记的引物对都扩增得到目的基因产物。在次柏样品叶片混合物中，n1、n2、n4、n8、n9、n10、n11、n13、n15、n16、n18、n20、n22、n23、n25、n27、n29、n31、n32、n33、n34、n35、n6，n14，n19和n28的叶绿体微卫星分子标记的引物对都扩增得到目的基因产物。在藏柏样品叶片混合物中，n1、n2、n4、n8、n9、n10、n11、n13、n15、n16、n18、n20、n22、n23、n25、n27、n29、n31、n32、n33、n34、n35、n6，n14，n19和n28的叶绿体微卫星分子标记的引物对都扩增得到目的基因产物。4.多态性引物复筛4.1提取单个柏树品种的叶绿体dna样品采用改良的ctab法分别提取侧柏叶片24份样品(c1～c24)、藏柏叶片8份样品(z1～z8)、圆柏叶片8份样品(y1～y8)、刺柏叶片8份样品(ci1～ci8)的叶绿体dna。4.2检测dna的纯度及完整性采用超微量紫外分光光度计测量c1～c24样品叶绿体dna、z1～z8样品叶绿体dna、y1～y8样品叶绿体dna、ci01～ci08样品叶绿体dna的含量(μg/ml)检测dna的纯度。a260nm/a280nm的值在1.9左右及其在260nm处＞0.1的吸收峰为纯度满足要求的dna。采用琼脂糖凝胶(1％)电泳检测dna的完整性。电泳图中无拖带的柏树叶绿体微卫星分子标记为完整dna，4.3三引物法荧光pcr扩增①制备三引物，26对引物的正向引物的5’端加上m13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记的通用型m13引物(序列为：fam-tgtaaaacgacggccagt))，形成与微卫星分子标记对应的三引物。②分别步骤4.2选出的以高纯度c1～c24样品、z1～z8样品、y1～y8样品、ci1～ci8样品的叶绿体dna为模板进行pcr扩增，扩增反应体系如下：2×taqpcr预混溶液(含4nmoldntp+0.5utaqdna聚合酶)10μlm13标记的正向引物(1μm)0.8μl，反向引物(1μm)3.2μl，荧光标记的m13引物(1μm)3.2μl，模版dna2.0μl，ddh2o0.8μl，用pcr纯等级水补足至20μl。②pcr扩增程序如下：94℃，预变性5min；94℃，变性30s，50～59℃，退火30s，72℃，延伸40s，35个循环；72℃，延伸5min；4℃保存。4.4毛细管凝胶电泳检测荧光pcr产物荧光pcr产物送至睿博兴科(北京)生物科技有限公司进行毛细管凝胶电泳检测，具体操作如下：96孔板各孔中分别加入0.5μlgs-500liz分子量内标、9.5μl去离子甲酰胺、0.3μl30～40倍稀释的荧光pcr产物，c1～c24样品、z1～z8样品、y1～y8样品、ci1～ci8样品扩增所得pcr产物各做一个复孔。95℃变性5min，4℃冷却后离心，各取0.3μl于abi3730xldna分析仪上进行毛细管电泳。毛细管温度63℃；1.6kv电进样15s；电泳15kv，1600s。利用genemarkerv2.4.0软件读取原始数据，48份样品pcr扩增的dna片段大小如表3～表4所示。表3.48份样品pcr扩增的dna片段大小(单位bp)表4.48份样品pcr扩增的dna片段大小(单位bp)由表3～表4可知，本发明从巨柏(cupressusgigantean)、地中海柏木(cupressussempervirens)、北美樱桃圆柏(juniperusmonosperma)、百慕大桧(juniperusbermudiana)、落基山圆柏(juniperusscopulorum)和北美圆柏(juniperusvirginiana)中筛选出的26个叶绿体微卫星分子标记序列在供试的48个柏树样品中表现出多态性，在侧柏、圆柏、刺柏、藏柏中具有通用性。由此可见，本发明提供的叶绿体微卫星标记可用于侧柏、圆柏、刺柏、藏柏的指纹图谱构建及遗传关系分析。利用genealex软件统计分析等位基因数(numberofalleles，na)、有效等位基因数(effectivenumberofalleles，ne)、香农-威纳指数(shannon-wienerindex，i)、多态性(diversity，h)、无偏差多态性(unbiaseddiversity，uh)，如表5～表8所示。表5.分析利用26对引物扩增所得的c1～c24侧柏的ssr位点选取ne＞2的多态性引物。由表5可知，n2、n8、n11、n13、n20、n27对应的引物扩增得到的侧柏叶绿体微卫星序列在供试的24份侧柏样品的扩增出多态性条带的重复性很高，因此我们认为，n2、n8、n11、n13、n20、n27是本发明人筛选得到的表现出高度多态性的叶绿体微卫星分子标记，其引物对为高度多态性的叶绿体微卫星分子标记的引物。表6分析利用26对引物扩增所得的y1～y8圆柏的ssr位点根据上述数据，编号为n32、n13、n14和n28的ssr位点对应的引物扩增得到的圆柏叶绿体微卫星序列在供试的8份圆柏样品中表现出最高度的多态性。表7分析利用26对引物扩增所得的的z1～z8藏柏ssr位点上述数据，编号为n1、n2、n4、n8、n10、n11、n13、n15、n16、n18、n20、n22、n25、n27、n29、n31、n32、n33、n34、n35的叶绿体微卫星分子标记的ssr位点对应的引物在供试的8份藏柏样品中表现出多态性表8分析利用26对引物扩增所得的c11～ci8刺柏的ssr位点根据上述数据，编号为n2、n11和n35的叶绿体微卫星分子标记的ssr位点对应的引物在供试的8份刺柏样品中表现出多态性。编号为n11的叶绿体微卫星分子标记的ssr位点对应的引物供试的在侧柏，圆柏，刺柏和藏柏都表现出最高的遗传多态性。上述数据分析表明，本发明的方法可筛选具有高度遗传多态型的柏树微卫星分子标记。实施例二.一种利用实施例一提供的柏树微卫星分子标记的多态性引物分析柏树遗传多样性的方法。利用实施例一筛选出的编号为n2，n8，n11，n13，n20，n27的叶绿体微卫星分子标记的多态性引物，采用三引物法扩增192个侧柏叶片样品的叶绿体微卫星分子标记，样品来源于河南郏县侧柏种子园，毛细管电泳检测荧光pcr产物的分子大小，利用genemarkerv2.4.0软件收集原始数据并进行供试样品的遗传多样性分析。具体操作如下：1.提取单个样品的叶绿体dna采用改良的ctab法分别提取192份侧柏叶片样品的叶绿体dna(提取方法与实施例1相同)。2.检测dna的纯度及完整性采用超微量紫外分光光度计测量192份侧柏样品叶绿体dna的含量(μg/ml)、a260nm/a280nm的值及其在260nm处的吸收峰，检测dna的纯度。采用琼脂糖凝胶(1％)电泳检测dna的完整性。电泳图中无拖带的柏树叶绿体微卫星分子标记为完整dna，3.三引物法pcr扩增①制备三引物，分别在实施例一筛选出的6个侧柏叶绿体微卫星分子标记(n2，n8，n11，n13，n20，n27)的多态性引物的正向引物5’端加上m13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记hex的通用型m13引物(序列为：hex-tgtaaaacgacggccagt)，形成与微卫星分子标记对应的三引物。②分别以192份高纯度侧柏叶绿体dna为模板进行荧光pcr扩增，扩增反应体系如下：③pcr扩增程序如下：94℃，预变性4min；94℃，变性30s，60℃，退火30s(每循环降低0.5℃)，72℃，延伸45s，共20循环；94℃，变性30s，50℃，退火30s，72℃，延伸45s，共20循环；72℃，延伸10min；4℃保存。4.毛细管电泳检测荧光pcr产物192份侧柏叶绿体dna荧光pcr产物送至睿博兴科(北京)生物科技有限公司分4次完成毛细管电泳检测。具体操作如下：96孔板各孔中分别加入0.5μlgs-500liz分子量内标、9.5μl去离子甲酰胺、0.3μl30～40倍稀释的荧光pcr产物，192样品所得pcr产物各做一个复孔。95℃变性5min，4℃冷却后离心，各取0.3μl于abi3730xldna分析仪上进行毛细管电泳。毛细管温度63℃；1.6kv电进样15s；电泳15kv，35min。利用genemarkerv2.4.0软件读取原始数据，192份样品pcr扩增的dna片段大小如表9所示。表9.192份样品pcr扩增的dna片段大小(单位bp)利用genealex软件统计分析等位基因数(numberofalleles，na)、有效等位基因数(effectivenumberofalleles，ne)、香农-威纳指数(shannon-wienerindex，i)、多态性(diversity，h)、无偏差多态性(unbiasdiversity，uh)，如表10所示。表10分析利用6对引物扩增所得的侧柏的ssr位点ssr位点样本数等位基因(bp)naneihuhn2192354，356，384，416，44851.1140.2770.1020.103n8192279，281，283，285，287，289，291，293，29992.4471.2940.5910.595n11192250，252，284，29241.4170.5330.2940.296n13192293，29921.0510.1160.0480.049n20192211，213，215，217，21951.3950.6780.2830.285n27192308，310.312，314，316，218，33071.2580.490.2050.206由表10可知，6对引物扩增192份侧柏叶片样品的叶绿体dna的ssr位点中结果中，n8扩增后得到的条带最多，包括9种长度，最少的是n13，只有2种长度。在反映多样性方面，毛细管电泳检测到的等位基因个数为2～9个，平均等位基因个数为6个/每个位点；平均有效等位基因数为1.447，变化范围为1.051～2.447；香农-威纳指数平均值为0.56，变化范围为0.116～1.294，其中n8的香农-威纳指数值最大，为1.294，最小的是n13，为0.116。多态性变化范围为0.048～0.591，无偏差多态性变化范围为0.049～0.595，平均值为0.25。根据上述参数的平均值可揭示出供试的192份侧柏样品具有高水平的遗传多样性。实施例三一种利用实施例一提供的柏树微卫星分子标记的多态性引物鉴定柏树亲缘关系的方法。利用实施例一筛选出的编号为n2，n8，n11，n13，n20，n27的叶绿体微卫星分子标记的多态性引物，采用三引物法扩增192个侧柏叶片样品的叶绿体微卫星分子标记，样品来源于河南郏县侧柏种子园，毛细管电泳检测荧光pcr产物的分子大小，利用genemarkerv2.4.0软件收集原始数据并进行供试样品的遗传多样性分析。具体操作如下：1.提取单个样品的叶绿体dna采用改良的ctab法分别提取192份侧柏叶片样品的叶绿体dna(提取方法与实施例1相同)。2.检测dna的纯度及完整性采用超微量紫外分光光度计测量192份侧柏样品叶绿体dna的含量(μg/ml)、a260nm/a280nm的值及其在260nm处的吸收峰，检测dna的纯度。采用琼脂糖凝胶(1％)电泳检测dna的完整性。电泳图中无拖带的柏树叶绿体微卫星分子标记为完整dna，3.三引物法pcr扩增①制备三引物，分别在实施例一筛选出的6个侧柏叶绿体微卫星分子标记(n2，n8，n11，n13，n20，n27)的多态性引物的正向引物5’端加上m13尾巴序列、特异反向引物以及带有荧光标记hex的通用型m13引物(序列为：tgtaaaacgacggccagt))，形成与微卫星分子标记对应的三引物。②分别以192份高纯度侧柏叶绿体dna为模板进行pcr扩增，扩增反应体系如下：③pcr扩增程序如下：94℃，预变性4min；94℃，变性30s，60℃，退火30s(每循环降低0.5℃)，72℃，延伸45s，共20循环；94℃，变性30s，50℃，退火30s，72℃，延伸45s，共20循环；72℃，延伸10min；4℃保存。4.毛细管电泳检测荧光pcr产物192份侧柏叶绿体dna荧光pcr产物送至睿博兴科(北京)生物科技有限公司分4次完成毛细管电泳检测。具体操作如下：96孔板各孔中分别加入0.5μlgs-500liz分子量内标、9.5μl去离子甲酰胺、0.3μl30～40倍稀释的荧光pcr产物，192样品所得pcr产物各做一个复孔。95℃变性5min，4℃冷却后离心，各取0.3μl于abi3730xldna分析仪上进行毛细管电泳。毛细管温度63℃；1.6kv电进样15s；电泳15kv，1600s。利用genemarkerv2.4.0软件读取原始数据，利用genealex软件导出数据文件，用populations-1.2.32算的矩阵，再用splitstree4.14.2算出的树的表示公式，最后用figtreev1.4.2完成做图，所得系统进化树图如图17所示。图17的系统进化树显示，形成9个显著地分支，判断本实施例分析的192个侧柏个体(编号为c1～c192)，分属于9个类群，分别为命名为a、b、c、d、e、f、g、h、i，其中类群a类群又包括a1和a2两个明显的子类群；a1子类群包括包括编号为c63，c58，c95，c93，c112，c110，c100，c177，c150，c232，c215，c34，c114，c41，c221，c98，c30，c47，c72，c118，c45，c57，c192，c49，c76，c109，c140，c148，c8，c15，c25，c54，c79，c131，c7，c85，c92的个体；a2子类群包括编号为c225，c217，c180，c226，c181，c178，c161，c159，c51，c32，c223，c136，c151，c1，c3，c42，c160，c153，c143，c136，c123，c115，c235，c228，c216，c193，c190，c174，c153，c154，c149，c147，c145，c141，c133，c130，c121，c119，c111，c108，c107的个体，类群b包括b1、b2和b3三个子类群；其中，b1子类群包括编号为c5，c206，c52，c86，c60，c233，c242，c62，c11，c117，c84，c219，c65，c22，c73，c94，c91，c103，c127，c158，c188，c229，c139的个体，b2子类群包括编号为c124，c35，c240，c231，c102，c82，c116，c78，c137，c164，c165的个体，b3子类群包括编号为241，21，237，48，238，2，142，230，163，146，105，10的个体。c类群包括编号为c134，c196，c239，c216，c9，c250，c222，c212，c234，c227，c243，c246，c248，c224，c245，c241，c245，c241，c155，c196的个体。d类群包括编号为c89，c44，c83和c40的个体。e类群包括编号为c10，c200，c199，c56，c198，c20，c202，c55，c27，c67，c77，c68，c61，c157，c113，c129，c209，c220的个体。f类群包括编号为66，39，23，和18的个体。g类群包含编号为c256，c251，c252，c254，c255，c253，c257，c258的个体，i类群包括编号为c264，c265，c6，c2，c262，c259，c266，c261，c260的个体。其余未进入类群的个体与9个类群成并列关系。a类群中，a1类群的个体之间亲缘关系最近，a2类群的个体之间亲缘关系最近，b类群中，b1类群内的个体之间，b2类群的个体之间和b3类群的个体之间亲缘关系最近。图17所示的系统发育树图中，个体分开的较彻底，最后树枝端有出现并列的个体标号时表示个体被没有分开，个体间隔得节点越多说明他们的亲缘关系越远，说明了使用了这些分子标记较有效地得出个体间的亲缘关系并且可用于遗传多样性的研究。本发明利用柏树叶绿体微卫星分子标记的多态性引物进柏树遗传多样性分析，并利用叶绿体微卫星分子标记具有细胞核基因组微卫星分子标记的共显性、高度变异和多态性等特点，且柏树的叶绿体为父性遗传，这使叶绿体的dna具有的单亲遗传模式、且不易发生重组的特点，同时使得叶绿体微卫星分子标记具有操作简单，重复性强，高变异以共显性等特点，使得发明提供的柏树遗传多样性分析方法更全面，也可将叶绿体微卫星分子标记与细胞核dna分子标记综合运用，能够更进一步全面、客观地反映物种细胞质的遗传变异现状。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>北京林业大学北京市农林科学院<120>柏树微卫星分子标记组合、筛选方法及在鉴定亲缘关系中的应用<130>2<160>26<170>patentinversion3.5<210>1<211>410<212>dna<213>c.gigantean<400>1gaatagaataattcggctagaggaaaggtatttgtctaatatctaatattctagattact60cgatggggtcggtggatcagtagatccaggcccagggggggggcaaggatctgcaatcta120ttctagctcgcacccaaactgagctgaagtatgatggtttgtatttgtgtctattaaaag180ttaagttgtacatgtaacaatatatatatagaaaaaatatgagaaaatgtgtgaagaaaa240caaagattctgaaaaaatgtgtgaagaagacaaagattctgaaaaaatgtgtgaagaaga300caaagattctgaacatatcggcgaaacaaaacctgtagaaaacagattgaattcggaacg360ttttaaacatttgtggtttttgtgcgagaattgtgagaccgttatatata410<210>2<211>412<212>dna<213>c.gigantean<400>2cgcaatgattggtcataccattgctgttcataatggaaaggtacatttacccatttttat60aacaaatggtatgataaaccacaaattaggagaatttgcacctacttccattttccaggg120acatgcgaaaaaggataaaaaatcgaaaaacgaaaaaaaaaaaaaataagaaaaaagcaa180caaaaataaaaaaaaaaaacacacacacacaaaaaagaaagagagaaacgataaataaaa240aagtcttgttgtaaatagtatacattaattcattatggaggatgaagatgaaattgatat300ttcaaaatagggatttagaatttaattcaactataagaatacgagctgtagctaaacatg360tacgtatgtcttctaataaagcacgtagagtagcccatttacttcgtaattc412<210>3<211>424<212>dna<213>c.gigantean<400>3ataatgaagaattatgtaaagatttttctattgaattgaatttaataatagatagagagt60agacaaaaaaaaatcatgaaggattatgattattataacatccaatttgtcctgtaaatt120ctaatttgtataatacctatacagcttcttatttcttcggaagaagaagatgatatgtag180ctttttttatgtatgtaaataagtaagtaagtaagtaagtaagtatgtaagtatgtaagt240aagtatgtaatgagcttgagtttaacgaacattccaaaagttccatatctgggggacggg300aaaggagaagaaggaaaagaaggaaaagaaggaaaagaaggaaaagaaggaaaagaagga360gaagaataccaaaacgaagaagaataccaaaacgaagaagaataccaaaacgaagaagaa420tacc424<210>4<211>415<212>dna<213>c.gigantean<400>4attttttttctaatatctgggaacaaccagaattggaatttgtaatatcgacttttcttg60taatagttttttttagttgccgcgcaaaatttatcgacagtcatctttttctttttgggt120ttggaagaatcacaattcttttttttctttttggaagaaaaaaactttttccaagaagaa180tcatttttcttcttcttcctcttcttcttcttcttgcaaaaaccgggattttgaaaatta240gtaatagcttgataatccggttccggtatatattgaattgcgggtccatgattattctct300ttcatatgatccagataactatatgccaaaatatcatatctgtgacgtttgatccggttc360ttgagtcgtgccataaaagtggcaaagcgcttctctcccaaaaacgatgcaaatt415<210>5<211>424<212>dna<213>c.gigantean<400>5ctgttttactttttttattggctatgggtctaaatttcgaagagatttttaactataaga60atgttaaagcgtttttccaatattcgaaggagtattatacatacaagtacgattggtatg120gcgggaagcggaaagctattttaaaactttataaaaaactttacataagtgacgaaaatg180aagaagaaggagaagaaggagaagaagaagaagaagaagaagaattggattttgagtcta240tagatgaaaaagtaacaacattttttcgaacgaaatttttattaggaaagatgggtcgac300gaaatctgaataaaaaactaagtcttgatatacccgagaacgaaattttattattaccgt360acgatatattggctgctgtggattaccttatcaaagtgcaatttggagcaggtacacccg420atga424<210>6<211>412<212>dna<213>c.gigantean<400>6attagaaaatttaaagaatgaaaccgttcaattggaacaacaaagagtaattgaacaggt60tcgacaacaaatttctcgccaagctgtccaaagagctctaggaactctgaataatcgtct120gaatagtgagttacatttacgtacgatcgagcataatatcgacttgctgctaggcatgaa180aaacataactgattaacgttatatatatatactaggtcttatttttcaaaagagaattaa240ctagtgttaatggtaactattcgacccgatgaaatcagtagtatgatacgtaaacagatt300gaacaatataataacgaagtcaaggttgttaatattggcactgtacttcaagtaggagat360ggcattgctcgtattcatggtcttgataaagtaatgtcaggggaattagtag412<210>7<211>410<212>dna<213>c.gigantean<400>7agattcgggaacgaaagagaaagaataggtaggtaacatgggcatgaaaaatgaaataag60aataagaaatatgaatgagcgggtagcgggaatcgaacccgcatcgttagcttggaaggc120taggggttatagtcgacgttgattaacgcctctaattcagaaccgaacatgaaaatttca180tttcattcggctcctccatgagagagagatagaaagggaggtctgataaaaaaaacgctt240tttcacatcacataatacataaattatttatgctctgctccataacatctatgttagttg300tatttgtagttctttcctcttaacttcaggtgaagaaccttaaatagaaaatacctattc360acttgatagatgatccctatagaaagataagatttaaaaattattaatat410<210>8<211>414<212>dna<213>c.gigantean<400>8gttatgattattaacacattctttagaataattcaagtaatttggaattagtttttcttt60atgacagatatagaaaataagaatgatccactcttagtctttgaaatctcttttttaccc120ttcaatatgatctatacattttcaatccaatctagaacatctcatccagattataatctg180aaatagttggaataaaaaaatatatatatatatagcaagtgcttatctattaatcttata240ataagagataaaaatataatacataaaaggaaatataagaaatgatatcacaaggtcaaa300ttttgatagccctttttattgctgttacttttataataatgattttagctttcagattag360gtagagcactgtattcttcataatttagtcaattaattccttatctaggaaaga414<210>9<211>412<212>dna<213>c.sempervirens<400>9tgaaaaaaaatcaacgggtatttccagatatacgactcgaaaaaatcgccgcaatactcc60taatcgattggaattaaaaaaattttgtccttcttgttacaagcataccattcatggaga120aatcaaaaaatagattgaatctaacatttctgcccagaaatagaaatatatattgaagat180attgatttctttatctttgtatatatatatattaacaagtcactgtcaatatttcttttc240gaaatattttgaaacaaaataaatagtatttgaaaggttcataaaacaaactatgaataa300aatgaagccatcttttcggaatacatataaaccatattctcaaaatagatctaataagtt360tagaaatatatctaaattgagaagtagatataaattgagaagtagatctaaa412<210>10<211>481<212>dna<213>c.sempervirens<400>10ttataacatccaatttgtcctgtaaattagaatttgtataatacctatacagcttcttat60ttcttcggaagaagaagatgatatgtagcttttttgatgtatgtaaataagtaagtaagt120aagtatgtaagtaagtatgtaatgagcttgaatttaacgaacattccaaaagttccatat180ctggtggacaggaaaagaaaaaaagga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