用于筛选小麦抗叶锈病qtl的引物及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及包括核酸的测定或检验方法技术领域。
【背景技术】
[0002] 禾本科农作物小麦是全世界广泛种植的重要粮食作物，其总产量仅次于玉米，全 世界内35%-40%的人口以小麦为主粮。在我国，小麦的种植区域很广，其主要种植于河南、 山东、江苏、河北、湖北、安徽等省，主要以冬小麦为主，其种植面积和总产量仅次于水稻，居 我国粮食作物第二位。由小麦叶锈菌（/ 5WCCiflia 引起的小麦叶锈病是一种世 界性病害，发生严重时可造成很大的产量损失，主要为害小麦叶片，很少发生在叶鞘及茎杆 上。发病初期，在叶片上首先出现褪绿斑点，后慢慢扩展，后期在叶片上长出褐色夏孢子堆， 该病害为气传病害，分布范围很广，在世界各小麦种植区域均有发生，会造成严重的产量损 失。在我国，1969、1973、1975、1979、2012和2015年间小麦叶锈严重流行，造成了重大的经 济损失。生产实践证明，培育和利用抗病品种是控制小麦叶锈病最经济有效且对环境安全 的重要手段。加强小麦品种及其遗传资源的抗病性研究，对于病害持续控制、确保小麦安全 生产至关重要。小麦品种抗病基因研究是抗病育种及抗病基因合理布局的基础工作，逐步 探明品种和抗源所具有的抗病基因，对建立抗源的遗传多样性具有重要意义。
[0003] 小麦对叶锈病的抗性，根据是否为小种专化型分为两种，一种是小种专化抗性，另 一种是非小种专化抗性。小种专化抗性是目前研究最多并且最清楚的防卫体系，这种抗性 为单基因抗性，也称为"垂直抗性"，常表现出过敏性坏死反应（HR)，其抗病机理是病原生理 小种中的一个无毒基因与宿主中的一个抗病性基因两者之间产生特异的作用，寄主对病原 菌某个或少数生理小种表现为免疫或者高抗，而对另一些生理小种则表现为感病，这类抗 性通常是由单个或少数主效抗病基因控制的，具有明显的抗感差异，表现为质量性状。非小 种专化抗性，又称水平抗性，当一个品种抵抗一种病原物的所有小种时，其抗性一般为水平 抗性。寄主对病原菌的抗性表现不如垂直抗性，但其对所有生理小种反应基本一致，水平抗 性通常由多个微效基因控制，表现为数量性状。具有这种抗性的品种一般表现为中等抗性 和慢病性，且不会因病原菌生理小种变异而丧失抗性，表现更加持久和稳定。这些控制数量 性状的基因构成数量性状位点（quantitative trait loci，QTL)，不易使病原菌产生新的 变异，抗性比较持久。为了挖掘持久抗病基因，近年来人们已经开始关注成株期抗性，尤其 是具有持久抗性的成株期慢病性。目前已知的小麦成株慢叶锈基因有Zrt?符口 而且这些基因多数是兼抗多种病害，因此成株慢锈性基因的发掘对培育持久兼抗多 种病害的小麦品种具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物及其应 用，引物用于筛选小麦抗叶锈病QTL-说r. AeAay-iaS；利用与该QTL紧密连锁的分子标记可 以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明 中发现的新抗叶锈QTL及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种用于筛选小麦抗叶锈 病QTL的引物，QTL位于2DS染色体，标记区间为来自于感病亲本 Thatcher ;引物是由引物wms261和wms484的上下游核苷酸序列组成的引物对； 其中引物wms261由序列表中其上游序列（19个碱基)和下游序列（19个碱基)组成；弓丨 物wms484由序列表中其上游序列（20个碱基）和下游序列（19个碱基）组成，见表1。
[0006] 表1用于检测抗叶锈基因的两引物上下游序列
本发明所提供的用于筛选小麦抗叶锈病QTL的分子标记分别是gwm261和gwm484,标 记gwm261由引物wms261扩增获得（164 bp/194bp)，标记gwm484由引物wms484扩增获得 (143 bp/153bp)〇
[0007] 本发明还提供了引物在筛选小麦抗叶锈病QTL中的应用。
[0008] 本发明应用的具体方法为：以待测小麦基因组DNA为模板，分别在引物丽is261和 wms484的引导下进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测；当用wms261扩增的产物有164 bp 条带，并且用wms484扩增的产物有143 bp条带时，则待测小麦含有目的小麦抗叶锈病QTL ; 当用丽is261扩增的产物有194 bp条带，并且用丽is484扩增的产物有153 bp条带时，则待 测小麦不含有目的小麦抗叶锈病QTL。
[0009] 优选的，PCR扩增： 10 μ L PCR 反应体系为：10 X buffer 1 μ L、10 mmol L 1 dNTP 0· 2 μ L、4 μ mol L 1 引物141^、30即41^10嫩模板141^、71(3濟每0.5 1]、(1(1!120 6.7 41^; PCR反应程序为：94°C预变性5 min ;94°C变性45 sec，55°C退火45 sec，72 °C延伸 45 sec，35个循环；最后72°C延伸10 min，10°C保存，PCR结束后在每个反应体系中加入 2. 5 μ L 6X Loading buffer〇
[0010] 优选的，对扩增产物进行检测是：对扩增产物在12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中 进行电泳分离，然后银染显色。
[0011] 罗马尼亚小麦品系Fundulea 900在苗期和成株期对叶锈病均表现出良好的抗 性。王翠芬在成株期对Fundulea 900进行了成株抗叶锈性QTL分析，利用Fundulea 900 与Thatcher杂交、自交得到的的F2:3群体为材料，通过田间进行抗性的鉴定并结合分子标 记技术进行成株叶锈性QTL分析，结果检测到慢叶锈病基因存在于Fundulea 900中， 但是通过群体鉴定，发现在不含有的株系仍具有较低严重度，说明该群体可能还存在 其它微效抗叶锈QTL位点。由于ZrJ癌因具有较大效应，可能会掩盖其它基因表达，通过 用与紧密连锁的分子标记大群体，剔除含有的株系，重新构建了一 个含有70个株系的群体以分析该群体中含有的其它QTL。在重新构建的Fundulea 900/ Thatcher群体中，检测到了一个QTL位点QTL-^Zr. AeAay-iaS；其位于2DS染色体上，标记 区间为及隨激7-及隨必￥，能够在2012MDS和2013MDS环境中检测到，分别解释了 20. 4和 23. 4%的表型变异，其加性效应分别为13. 5和15. 0,该QTL位点来自于感病亲本Thatcher， 与该QTL紧密连锁的SSR分子标记可用于标记辅助育种培育持久抗病品种。
[0012] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于： (1) 本发明首次公开了一个新的小麦抗叶锈病QTL-说r. AeAay-iaS'; (2) 本发明首次公开了与上述小麦抗叶锈病QTL-说r. AeAay-iaS紧密连锁的SSR标记 gwm261和gwm484。利用与该QTL紧密连锁的分子标记可以对其进行标记辅助选择，从而实 现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性； (3) 本发明中发现的新抗叶锈QTL及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。
【附图说明】
[0013] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明； 图1是SSR引物wms261对亲本、抗病家系和感病家系单株的PCR扩增结果； 图2是SSR引物wms484对亲本、抗病家系和感病家系单株的PCR扩增结果； 图3是2DS染色体抗叶锈性QTL的位置。
【具体实施方式】
[0014] 用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物，QTL位于2DS染色体，标记区间为 遞?睛必￥，来自于感病亲本Thatcher ;引物是由引物wms261和wms484的上下游核 苷酸序列组成的引物对； 引物wms261的上游序列为：5' CTCCCTGTACGCCTAAGGC 3'，下游序列为：5' CTCGCGCTACTAGCCATTG 3' ； 引物wms484的上游序列为：5' ACATCGCTCTTCACAAACCC 3'，下游序列为：5' AGTTCCGGTCATGGCTAGG 3, 。
[0015] 应用本引物序列筛选小麦抗叶锈病QTL-^Zr. AeAaw-iaS的具体方法如下： 1、 提取待测小麦基因组DNA为模板； 2、 以wms261和wms484为引物、待测小麦基因组DNA为模板，进行PCR扩增。10 yL PCR 反应体系为：10Xbuffer I yL、10 mmol L1 dNTP 0.2 yL、4 μπιο? L1引物 I yL、 30即41/0嫩模板141^、71(^7酶0.5 1]、(1(1!120 6.7 41^反应程序是94°(：预变性5 1^11; 94°(：变性458扣，55°( ：退火458扣，72°(：延伸45 86(3,35个循环；最后72°(：延伸1〇1^11， 10°C保存。
[0016] 3、对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入2. 5 μ L 6XLoading buffer，在 浓度为12% (w/v)的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，若用wms261扩增的产 物有164 bp条带，并且用wms484扩增的产物有143 bp条带时，则待测小麦含有小麦抗叶 锈病QTL-^Zr. AeAay-iaS';若用wms261扩增的产物有19