一种用于筛选小麦抗叶锈病qtl的引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包括核酸的测定或检验方法技术领域。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上种植面积最大、总产量和总贸易额最大且具有很高营养价值的粮食 作物，在世界各产麦大国中中国居于首位，且小麦是我国三大主粮作物之一，种植面积仅次 于水稻和玉米，全国约一半人口以小麦为主要食物，搞好小麦生产对我国社会稳定和国民 经济持续健康发展具有重要作用。由小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病 是一种世界性病害，发生严重时可造成很大的产量损失。在我国，过去小麦叶锈病主要在西 南及长江流域的部分地区发生较重，如贵州、江西等，近年来随着全球气候变暖，华北、西北 及东北各地小麦叶锈病的发生也日趋严重，对我国小麦生产影响很大，特别是在2012年， 小麦叶锈病在我国大部分小麦主产区严重发生，对我国小麦生产造成巨大损失。生产实践 证明，培育和利用抗病品种是控制小麦叶锈病最经济有效且对环境安全的重要手段。加强 小麦品种及其遗传资源的抗病性研宄，对于病害持续控制、确保小麦安全生产至关重要。小 麦品种抗病基因研宄是抗病育种及抗病基因合理布局的基础工作，逐步探明品种和抗源所 具有的抗病基因，对建立抗源的遗传多样性具有重要意义。
[0003] 小麦对叶锈病的抗性，根据是否为小种专化型分为两种，一种是小种专化抗性，另 一种是非小种专化抗性。小种专化抗性是目前研宄最多并且最清楚的防卫体系，这种抗性 为单基因抗性，也称为"垂直抗性"，常表现出过敏性坏死反应（HR)，其抗病机理是病原生理 小种中的一个无毒基因与宿主中的一个抗病性基因两者之间产生特异的作用，从而限制病 原菌小种对宿主的侵染，该过程时常伴随着一系列的生化反应，例如：PR蛋白积累、氧化反 应及产生的一些代谢产物。由于病原菌新毒性基因不断进化和选择压力不断增强的原因， 这种单基因抗性一般不具有持久性，并且随着单基因抗性作物品种的大面积广泛种植，这 种抗性在短时间内就会丧失，严重地影响了防病效果和品质。
[0004] 在自然界中还有另一种抗性体系广泛存在，为非小种专化抗性，即多基因抗性体 系，该体系具有数量性状特性，称为"水平抗性"也可称为"田间抗性"，这种抗性对生理小 种没有明显的专化性，这些控制数量性状的基因构成数量性状位点（quantitative trait loci，QTL)，不易使病原菌产生新的变异，抗性比较持久。为了挖掘持久抗病基因，近年来人 们已经开始关注成株期抗性，尤其是具有持久抗性的成株期慢病性。目前已知的小麦成株 慢叶锈基因有訝P Zrft?，而且这些基因多数是兼抗多种病害，因此成株慢锈 性基因的发掘对培育持久兼抗多种病害的小麦品种具有重要的意义。
[0005] 目前，在作物育种研宄中被广泛应用的分子标记技术主要有以下几种：RFLP技 术、RAPD技术、AFLP技术、SSR技术。除此之外，还有几种新型的分子标记技术，如SNP 技术、SRAP技术等。SSR(Simple Sequence Repeats)即简单序列重复，又称微卫星 DNA (Microsatellite DNA)，是由Moore等（1991)首先建立。该技术是一种普遍存在 于动植物基因组的编码区和非编码区，由1至6个碱基组成的简单重复序列（Gupta et al. 1996; Tautz and Renz 1984; Tautz et al. 1986; Tautz 1989)。重复次数变化很大，可 达百次以上。该重复序列有一个重要的特征，即其两端的侧翼序列通常是一段保守性较强 的单一序列。该技术的原理是：首先根据微卫星序列两端的保守序列设计引物，通过PCR反 应扩增微卫星片段，然后借助于聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再经染色显色反应进行显 影，最后通过比较谱带的相对迀移距离，便可知道不同个体在某个SSR座位上的多态性。
[0006] 该技术的优点是：数量丰富，多态性高；具多等位基因的特性，信息量高；孟德尔 方式遗传，共显性表达；每个位点由设计的引物序列决定，便于不同实验室相互交流合作并 开发引物；DNA用量少，DNA质量要求不高。SSR技术作为以PCR为基础的第二代分子遗传 标记技术，现已成为小麦育种各性状基因标记定位研宄中最常用的一种方法。
[0007] 小麦品系周麦22是河南省周口市农业科学院从杂交组合周麦12/温麦6号// 周麦13号中育成，2007年由国家农作物品种审定委员会审定。该品种，在田间高抗条锈病 和叶锈病，并且亩产量很高。中国春是来自我国四川省的地方品种，田间对小麦叶锈病虽 然在侵染型上表现感病，但是却表现较低的严重度(一般在20-30%)，具有慢锈性的特点，可 能携带有微效抗病QTL位点。为了鉴定周麦22和中国春中的成株抗叶锈病基因，在田间 利用混合菌种接种周麦22、中国春及其杂交自交得到的F 2:3群体进行抗叶锈性鉴定，并利 用1200对分子标记在亲本和抗感小群体间进行筛选，具有多态性的标记进一步检测215个 F2:3家系。结合田间病害严重度和分子标记检测的基因型数据，利用软件Manager QTXbl7 和QTL Ici Mapping3. 1进行连锁作图和QTL分析，发现了一个来自中国春位于4B染色体 的QTL--游。该QTL在2011-2012、2012-2013和2013-2014连续三个生长年份内 均在标记区间你 iST勝?内被检测到，表型贡献率分别为7. 02%、10. 67%和20. 22%， 与该QTL紧密连锁的SSR分子标记可用于标记辅助育种培育持久抗病品种。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是提供一种用于筛选小麦抗叶锈病QTL的引物及其应 用，引物用于筛选小麦抗叶锈病QTL-^Lr. 视利用与该抗病QTL紧密连锁的分子标记可 以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明 中发现的新抗叶锈QTL及其专用引物将在小麦持久抗病育种中发挥重要作用。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种用于筛选小麦抗叶锈病 QTL的引物，引物是由引物wmc692和wmc657的上下游核苷酸序列组成的引物对； 其中引物丽ic692由序列表中其上游序列（18个碱基）和下游序列（25个碱基）组成； 引物丽ic657由序列表中其上游序列（16个碱基）和下游序列（20个碱基）组成，见表1。
[0010] 本发明所提供的用于筛选小麦抗叶锈病QTL的分子标记分别是wmc692和wmc657， 标记wmc692由引物wmc692扩增获得（131 bp)，标记wmc657由引物wmc657扩增获得（158 bp) ο
[0011] 本发明还提供了引物在筛选小麦叶锈病QTL中的应用。
[0012] 本发明应用的具体方法为：以待测小麦基因组DNA为模板，分别在引物wmc692和 wmc657的引导下进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测；当用wmc692扩增的产物有131 bp 条带，并且用wmc657扩增的产物有158 bp条带时，则待测小麦含有小麦抗叶锈病QTLiZr. zh_4B。
[0013] 本发明应用的PCR扩增中： PCR 反应体系 10 yL，含 IOXbuffer I yL、10 mmol Γ1 dNTP 0.2 yL、4 μπιο? Γ1 引物141^、40叩41710嫩模板141^、7^禮11(1(1!120 6.7 41^ PCR反应程序为：94°C预变性5 min ;94°C变性I min，引物wmc692和wmc657的退火 温度分别为51°C和61°C，退火时间为I min，72°C延伸I min，35个循环；最后72°C延伸10 min，4°C保存，PCR结束后在每个反应体系中加入2.5 yL 6XLoading buffer。
[0014] 本发明应用中对扩增产物进行检测是：对扩增产物在12% (w/v)的非变性聚丙烯 酰胺凝胶中电泳分离，然后银染显色。
[0015] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明提供了一个新的小麦抗叶锈病 QTL-i?Zr. 的SSR标记wmc692和wmc657。利用与该QTL紧密连锁的分子标记可以对 其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。本发明中发 现的新抗叶锈QTL及其专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。
【附图说明】
[0016] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明； 图1是用SSR引物wmc692对亲本、抗病家系和感病家系单株的PCR扩增结果； 图2是用SSR引物wmc657对亲本、抗病家系和感病家系单株的PCR扩增结果； 图3a是4B染色体SSR标记位置； 图3b是4B染色体抗叶锈性QTL位置。
【具体实施方式】
[0017] -种用于筛选小麦抗叶锈病QTL-^Lr. 的引物，是由引物wmc692和wmc657 的上下游核苷酸序列组成的引物对； 引物wmc692的上游序列为：5' TTATCTTGATCCGAGCGA 3'，下游序列为：5' ATGTGATTAGTCCTAAGGTCTCTCT 3'； 引物wmc657的上游序列为：5' CGGGCTGCGGGGGTAT 3'，下游序列为：5' CGGTTGGGTCATTTGTCTCA 3' 〇
[0018] 应用本引物筛选小麦抗叶锈病QTL-说r. 的具体方法如下： 1、 提取待测小麦基因组DNA为模板； 2、 以wmc692和