Est-ssr标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种EST-SSR标记引物组合及其筛选方法 在豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析上的应用。
【背景技术】
[0002] 豌豆（Pisum. sativum L.)为二倍体（2n=2x=14)豆科植物，是世界第二大食用豆 类作物。菜用豌豆，也称甜豌豆，因其籽粒甘甜可口、风味独特、营养丰富，而深受消费者的 喜爱，在我国农产品加工出口市场中占据的份额日趋扩大，市场前景广阔。然而，我国现有 菜用豌豆主要为进口品种且老化严重，缺乏自主选育的优质高产品种。作为藤本植物的典 型代表，菜用豌豆在我国市场中的主要品种为蔓生型品种，需搭架种植，耗费的经济成本相 对较高，特别是目前劳动力成本的快速上升，严重制约了广大种植者经济效益的提升空间。 因此，大力开展菜用豌豆优质高产、矮化品种的选育，培育符合我国国情的优势品种势在必 行。
[0003] 然而，我国菜用豌豆育种工作起步较晚，特别是种质资源搜集和鉴定方面进展缓 慢，目前可利用的资源和品种不多，严重制约了育种进程。一方面，种质资源搜集鉴定过程 耗时耗工，特别是矮生/蔓生材料生长前期表型类似，难以快速鉴定；另一方面，由于豌豆 为常规种，市面上'一种多名'现象严重，对种质资源搜集和鉴定造成过多田间重复劳动因 此，利用分子标记进行种质资源鉴定和遗传多样性分析，将有助于精确鉴定豌豆种质，实现 快速分类，为育种打下坚实基础。
[0004] 目前，常用的分子标记有RFLP、RAPD、SSR和AFLP等。但基于分子杂交的RFLP分 析需要的总DNA量多，检测过程复杂，而且费用大，难以在育种实践中推广应用。RAPD需要 DNA量少，分析程序简单，但是它是显性标记，不能区分纯合和杂合型，且重复性差，在实际 应用中也存在一定的困难。AFLP的优点是多态性好，准确性高，灵活性强，但是它的分析程 序较复杂，而且成本较高，一般的育种单位难于接受。与其他分子标记相比，EST-SSR是一种 基于基因表达序列有关基因功能的"真质"标记，其多态性直接反映基因的多样性。在种质 资源鉴定、转录图谱的绘制以及功能基因发掘和利用方面发挥巨大的作用；而且EST-SSR 具有很高的通用性，一旦开发可以在许多相关物种中应用。随着NCBI数据库中登录的EST 库快速增加，EST-SSR标记系统已在水稻、大麦、小麦等农作物的农艺性状定位、遗传作图、 遗传多样性中成果应用。自2010年开始，我们率先开展了菜用豌豆EST-SSR标记开发工作 (Gong等，2010 ;Gong等，2011 ;Xu等，2012)，并获得了一批多态性EST-SSR标记。但是，豌 豆EST信息稀少，发展缓慢(截止2015年3月NCBI数据库中豌豆EST仍只有21，838条)， 严重制约了 EST-SSR分子标记的开发。而且，目前尚无针对矮生和蔓生豌豆材料的EST-SSR 标记体系。鉴于此，本发明以矮生和蔓生类型豌豆为材料，通过高通量转录组测序获得EST， 在此基础上开发EST-SSR标记，实现快速准确鉴定豌豆矮生和蔓生材料，并进行亲缘关系 分析。
【发明内容】
[0005] 本发明第一目的在于提供一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析 的EST-SSR标记组合。
[0006] 本发明第二目的在于提供上述EST-SSR标记组合的构建、筛选方法。
[0007] 本发明第三目的在于提供上述EST-SSR标记组合在进行豌豆种质资源鉴定。
[0008] -种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合，包 括12对EST-SSR可用引物，引物名称及序列分别为： PeaNsat-001， s:5' - TTGGAGACGGCATAACC-3'，a:5' -CCTTGCTTGGAGGAACT-3' ； PeaNsat-004，s:5 ' - CACAGAATGGGTTGAG-3 '，a: 5 ' -GTGGGGTTTGGATAGT-3 ' ； PeaNsat-021， s:5'- ATGGAGCGGAGGAGTTGG-3'，a:5'-CGATGATGCTGCGTTCTT-3' ； PeaNsat-022，s:5 ' - TCTTCACGCCTAAAACTC-3 '，a: 5 ' -AACCGAAACGAAATCAC-3 ' ； PeaNsat-029，s:5 ' - GAGACAATGATGGAACAAG-3 '，a: 5 ' -TGCCAAACTGACAGACAAA-3 ' ； PeaNsat-031， s:5'_ CTTAGTTTGCGACCAGC -3'，a:5'-CGTGAACGGAAGGACAT-3' ； PeaNsat-083， s:5' - TGTTGAGAAGCGTGAATG _3'，a:5' -CTCTTTTGGCTGGGATTA -3' ； PeaNsat-095，s:5' - AGTGGAAGGAGATGAACA -3'，a:5' -CTAATGGAAGGGGTAGAG -3 ; PeaNsat-100，s:5' - AAACCAAAACCACCCTAC _3'，a:5' -TTAGACTCAGAGCCAAATC -3' ； PeaNsat-113， s:5, - GCAACCTCGTCGCAAAAC -3，，a:5, -GCCGAAGATGAAGATGGA -3，； PeaNsat-124，s:5' - TTCCAGTAACCAACACCG -3'，a:5' -CAATTTCCCAAACACTACAC ; PeaNsat-125， s:5' - TGGCTTCACTGATACCTT _3'，a:5' -TCCACTGTTTTCTCCTCC -3' 。
[0009] 一种用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标记组合的构 建、筛选方法，包括如下步骤： (1)以矮生与蔓生类型豌豆为材料，应用新一代高通量测序平台（454 GS FLX)对cDNA 样品测序，对测序结果去杂分析，分别获取unigene 44, 720条和44, 449条，并构建高质量 cDNA文库，两文库合并后获独立基因42, 791条，共计38, 179, 780供SSR搜索分析；采用 SSRIT软件对非冗余序列进行SSR筛选分析。
[0010] (2)引物设计：利用Primer Premier 5. 0软件，对步骤（1)筛选分析的含有SSR 的unigene进行特异引物设计，引物正义链的5'端分别以FAM或HEX荧光染料标记；引物 设计的主要参数为：引物长度为17-24 bp，退火温度为50-60°C。
[0011] (3 ) PCR扩增：步骤（2 )设计的引物以豌豆DNA为模板进行PCR扩增反应，反应体 系总体积 20 yL，具体包括 1XPCR 缓冲液，2 ymol*L-lMgC12,0.2 ymol*L-ldNTPs，0.2 ymol*L-l 正引物，0.2 ymol*L-l 反引物，1 U Taq DNA 聚合酶及 15-25 ngDNA 模板；PCR 扩增反应程序为：94 °C预变性2 min;94 °C变性30 s，54 °C复性30 s，72 °C延伸80 s，43 个循环；最后72 °C延伸8 min。
[0012] (4)产物毛细管电泳检测：步骤（3)扩增产物混匀稀释后，加入ET550-R分子量内 标，95°C变性1 min，迅速冰浴至冷却，3000 r/min离心1 min，于MegaBACE 1000 DNA分析 系统上进行毛细管电泳；其中进样电压3 kV，进样时间45 s，电泳电压8 kV，电泳时间90 min〇
[0013] (5)标记筛选：用Genetic profiler软件对毛细管电泳检测原始数据进行分析， 筛选出12对ETS-SSR标记。
[0014] 进一步地，上述用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标 记组合的构建、筛选方法，其特征在于，所述步骤（1)对unigene序列进行SSR筛选分析中 筛选标准为：二基元重复8次以上，三基元重复5次以上，四基元重复4次以上，五基元以上 重复不少于3次。
[0015] 进一步地，上述步骤（1)样品测序中还包括高通量转录组测序过程，该过程以矮 生与蔓生类型豌豆为材料，提取植株总RNA，利用Oligotex? mRNA kit (Qiagen)分离纯化 mRNA;以mRNA为模板，反转录合成cDNA;对cDNA进行扩增，并去除体系中小于300 bp的 片段。
[0016] 进一步地，上述用于菜用豌豆矮生、蔓生类型种质遗传多样性分析的EST-SSR标 记组合进行豌豆种质资源鉴定的方法，包括如下步骤： (1)实验材料的准备：选取菜用豌豆进行育苗处理，待幼苗长至四叶时采集幼嫩叶片， 用液氮速冻后于_70°C保存.采用试剂盒法提取总DNA。
[0017] (2)以步骤（1)获得额DNA为模板，利用权利要求1所述的EST-SSR标记组合进行 PCR扩增。
[0018] (3)对步骤（3)中扩增产物进行毛细管电泳检测，用Genetic profiler软件对原 始数据进行分析，计算各目标DNA片段的大小；利用GenAlEx 6. 5软件进行种质材料遗传多 样性分析，区分不同种类豌豆。
[0019] 本发明提供的豌豆EST-SSR标记组合，用于豌豆遗传多样性分析及高/矮生类型 种质鉴定，有助于快速、准确地辨析菜用豌豆不同类型种质材料，分析其亲缘关系，为该物 种的定向育种奠定基础。
[0020] 说明书附图 图1、EST-SSR多态性生物荧光毛细管电泳结果示例。
[0021] 图2、同一泳道中不同荧光标记产物示例。
[0022] 图3、EST-SSR应用于矮生型和蔓生型菜用豌豆分类。
[0023] 图4、EST-SSR应用于矮生型和蔓生型菜用豌豆亲缘关系分析。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过实施例，对本发明【具体实施方式】进行说明。
[0025] 实施例1 EST-SSR标记引物组合及筛选方法在豌豆矮生、蔓生种质遗传多样性分析上的应用，其 具体步骤包括如下： (1)种质材料准备。
[0026] 本发明所利用的豌豆材料包括8份矮生豌豆和12份蔓生豌豆豌豆材料，见下表1。
[0027] 表1豌豆种质信息表。
[0028] (2)高通量转录组测序 以矮生与蔓生类型豌豆为材料，提取植株总RNA，利用Oligotex? mRNA kit (Qiagen) 分离纯化mRNA ;以mRNA为模板，反转录合成cDNA ;对cDNA进行扩增，并去除体系中小于 300 bp的片段