一套萝卜est-ssr核心引物组合及其应用的制作方法
【专利摘要】一套萝卜EST-SSR核心引物组合，所述引物组合包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～42所示引物。本发明获得的SSR核心引物组合具有能够最大限度反映萝卜种质材料遗传多样性、标记稳定可靠、重复性好、多态性高、便于统计等优点。利用该套引物组合进行遗传多样性分析，能够以最少的引物数量最大限度反映供试材料的遗传亲缘关系。
【专利说明】-套萝卜EST-SSR核心引物组合及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一套萝卜EST-SSR核心引物序列及其应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 萝卜在中国栽培历史悠久，分布广泛，品种类型十分丰富。据农业部近几年统计， 现每年播种面积约1800万亩，位居我国蔬菜种植面积前三位，在我国蔬菜周年供应中占有 重要地位。但是，目前中国萝卜种子市场混乱，在市场上存在同物异名或异物同名所导致的 品种真实性问题非常严重，在良种繁育、加工、储运等环节由于把关不严所导致的品种纯度 不高等种子质量问题也日益突出，严重干扰了萝卜种业的健康发展。现行的植物新品种特 异性、一致性和稳定性（DUS)测试主要依据行业标准考察品种的表型和主要农艺性状，但 存在鉴定周期长、易受环境影响、测试性状多等问题，给品种权纠纷、司法维权带来困难。
[0003] 基于DNA多态性的分子标记正逐渐成为分析生物遗传多样性的有力工具，因其具 有不受环境影响、测试周期短、供选择的标记数量多、可以进行高通量测试分析的优势，已 经逐步用于亲缘关系分析、种子纯度鉴定及品种真伪性检测。其中SSR标记技术具有共显 性、多态性好、重复性好、实验程序简单等优点，已经广泛应用于农作物DNA指纹库构建、遗 传多样性分析、遗传图谱及重要农艺性状的基因定位等方面。在萝卜上，目前已经开发了 大量SSR标记，并利用其构建了多张遗传连锁图谱，随着萝卜基因组测序的完成，将有更多 的标记被开发。但并非所有SSR引物具有同等检测效率，不同引物组合的检测能力差异极 大，我们无法准确判断引物组合是否正确地反映参试品种的特异性和遗传多样性。但如果 将基因组中的全部SSR对所有供试材料进行分析，需要消耗大量的人力物力，是不可能实 现的。为提高SSR技术的检测效率，玉米、小麦、西瓜等作物采用核心引物组合进行相关研 究，在我国以SSR核心引物为基础的玉米和水稻的品种鉴定DNA指纹技术已经形成国家标 准（NYT1432-2007，NYT1433-2007)。核心引物指均匀覆盖染色体全基因组、多态性、稳定性、 重复性等综合特性好，能够最大限度的反应每个品种的特异性。理论上只有进行每个品种 全基因组序列的比较才能正确反映不同品种的特异性，然而目前多数植物基因组测序计划 尚未完成，很难进行序列比较，只能通过反复筛选核心引物组合才能获得理想的试验结果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一套萝卜EST-SSR核心引物组合。
[0005] 本发明的再一目的在于提供上述核心引物组合的用途。
[0006] 本发明的发明思路为：针对上述现有技术的问题，本发明依据萝卜分子标记数据 库中的EST-SSR标记开发了一套SSR核心引物序列，可用于萝卜种质资源DNA指纹库构建 和遗传背景等研究。设计合成位于萝卜9条染色体上的626对EST-SSR引物进行多态性筛 选，以筛选出重复性好、多态性高、在染色体上均匀分布的核心引物备选引物。利用不同SSR 引物组合对93份品种材料进行遗传多样性分析，筛选获得鉴别效率最高、能最大限度准确 反映遗传多样性关系的核心引物组合。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -套萝卜EST-SSR核心引物组合，所述引物组合包括核苷酸序列如序列表SEQID No. 1?42所示引物。
[0009] 所述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜品种遗传多样性分析中的应用。
[0010] 上述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜杂种纯度鉴定中的应用。
[0011] 上述的SSR核心引物组合进行萝卜品种资源遗传多样性评价分析的方法，所述方 法包括如下步骤：
[0012] (1)提取待测萝卜样品基因组DNA ;
[0013] (2)采用如序列表SEQIDNo. 1?42所示引物进行PCR扩增；
[0014] (3)将步骤（2)的扩增产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并 统计结果，某位置若有条带记为'1'，若无则记为'〇' ；
[0015] (4)利用步骤（3)的统计结果进行遗传多样性分析。
[0016] 所述步骤（1)是采用CTAB小量法快速提取待测萝卜样本基因组DNA，步骤为：选 取适量植物组织（幼嫩叶片或下胚轴）置于2. OmL离心管中；加入750 ill CTAB缓冲液，在 48孔研磨器上研磨；65°C水浴30小时，每隔10分钟轻摇1次；冷却后加入750 ill体积比为 24 : 1的氯仿/异戊醇，上下混匀5分钟；12000rpm离心15分钟；取上清液约500iil，加 入预先加好500iil预冷异丙醇的2mL离心管中，轻轻晃匀；4°C静止沉淀1小时；12000rpm 离心15分钟，弃上清夜；加入300 yl的75 %乙醇洗涤，自然晾干DNA;加入100 yl的4〇 溶解DNA，-20°C保存备用。
[0017] 所述步骤（2)为PCR扩增：所述的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1?42所 示；PCR反应条件是：15 ill的反应体系中含有1.5 ill 10 X buffer (含Mg2+)，1.2 ill 2. 5mM dNTP，lU Taq DNA聚合酶，10iiM SSR上下游引物各加0.5iil，60ng模板DNA;反应程序为， 94°C预变性 4min，然后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 45s，循环 35 次，72°C延伸 4min 后保存在 l〇°C条件下。
[0018] 所述步骤（3)扩增产物的检测：在PCR扩增产物中加入2 ill上样缓冲液，用10% 非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。电泳缓冲液为1 X TBE，每个点样孔加2 yl样品，120V恒压下 电泳60?90分钟。电泳结束后利用银染法染色。先将凝胶放入固定液（450mL H20+50mL无 水乙醇+2. 5mL冰醋酸），在摇床上轻摇12min，回收固定液待用；加入银染液（500ml H20+lg 硝酸银），轻摇12min;倒掉银染液，用500ml蒸馏水洗30s，清洗两次；清洗后，倒掉蒸馏水 加入显色液（500ml H20+7. 5g Na0H+1500iU甲醛），轻摇至DNA条带显出为止；当条带清晰 时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟；倒掉固定液，用蒸馏水漂洗5分钟；照相并统计 带型。某位置若有条带记为'1'，若无则记为'0'。
[0019] 所述步骤（4)是使用NTSYS-pc Ver. 2. 10e软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使 用Picalc 0. 6软件计算各引物的PIC值（多态性信息量）。
[0020] 本发明基于萝卜 EST_SSR(Expressed Sequence Tag，Simple Sequence Repeat， EST-SSR)信息开发一套SSR核心引物序列，并使用该套核心引物准确进行萝卜种质资源材 料的遗传多样性分析。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明获得的一套SSR核心引物组合具有多态性高、重复性好，标记稳定可靠，便 于统计，能最大限度反映萝卜种质材料遗传多样性等优点。利用该套引物进行遗传多样性 分析，能最大限度准确反映供试材料的遗传亲缘关系。
[0023] 下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对
【发明内容】
有整 体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以 实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于 对本发明的侵犯。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1利用50对备选核心引物对20份材料的UPGMA聚类图与Shen et al. (2013) 利用1800对SNP标记构建的系统发育树比较；
[0025] 图2利用21对核心引物对20份材料的UPGMA聚类图；
[0026] 图3利用9对核心引物对20份材料的UPGMA聚类图；
[0027] 图4利用21个核心引物组合绘制的93份萝卜材料亲缘关系图谱。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1萝卜育种材料遗传多样性研究
[0029] -、材料和方法：
[0030] 1. 1 材料
[0031] 供试材料为93份萝卜种质资源。
[0032] 用于引物筛选的20份萝卜材料涵盖萝卜属栽培种的6个亚种R. sativus var. sativus L?(搜桃萝卜），var.hortensis Becker(东亚大长萝卜），var.niger Kerner(黑 萝卜），var. oleiferus Metzg (油萝卜），var. caudatus Hooker and Anderson (长荚 萝卜）和R. sativus var. raphanistroides Makino (东亚野萝卜）；3个野生萝卜种 R. raphanistrum，R. landra和R. maritimus。类型丰富，包括不同皮色（红、绿、白、黑）、不 同根型（圆、长圆柱、椭圆等）、不同大小的萝卜资源，基本涵盖了萝卜主要生态类型与主要 农艺性状，尽可能多地体现了种质多样性，具有较高的遗传多样性（表1)。
[0033] 其余73份萝卜育种材料，主要用于调整和验证核心引物及遗传多样性分析。
[0034] 1. 2研究方法
[0035] 1. 2. 1基因组DNA的提取
[0036] 选取适量植物组织（幼嫩叶片或下胚轴）置于2. OmL离心管中；加入750 ill CTAB缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65°C水浴30小时，每隔10分钟轻摇1次；冷却后加入 750 ill体积比为24 : 1的氯仿/异戊醇，上下混匀5分钟；12000rpm离心15分钟；取上 清液约500 yl，加入预先加好500 yl预冷异丙醇的2mL离心管中，轻轻晃匀；4°C静止沉淀 1小时；12000印111离心15分钟，弃上清夜；加入300111的75%乙醇洗涤，自然晾干0嫩 ；力口 入100 ill的H20溶解DNA ;用1 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，-20°C保存备用。
[0037] 1.2.2 SSR 分析
[0038] 所用626对EST-SSR引物来源于萝卜标记数据库，分布于萝卜9条连锁群。
[0039] PCR 反应条件是：15iil 的反应体系中含有 1. 5iil lOXbuffer (含 Mg2+)，1. 2iil 2.5mM dNTP，lU Taq DNA聚合酶，10iiM SSR上下游引物各加0.5iil，60ng模板DNA;反应 程序为，94°C预变性 4min，然后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 45s，循环 35 次，72°C延伸 4min 后 保存在l〇°C条件下。
[0040] 扩增产物的检测：在PCR扩增产物中加入2 ill上样缓冲液，用10 %非变性聚丙烯 酰胺凝胶检测。电泳缓冲液为1 x TBE，每个点样孔加2 iil样品，120V恒压下电泳60?90分 钟。电泳结束后利用银染法染色。先将凝胶放入固定液（450mL H20+50mL无水乙醇+2. 5mL 冰醋酸），在摇床上轻摇12min，回收固定液待用；加入银染液（500ml H20+lg硝酸银），轻 摇12min ;倒掉银染液，用500ml蒸馏水洗30s，清洗两次；清洗后，倒掉蒸馏水加入显色液 (500ml H20+7.5g Na0H+1500iU甲醛），轻摇至DNA条带显出为止；当条带清晰时，倒掉显 影液，加入固定液，固定2分钟；倒掉固定液，用蒸馏水漂洗5分钟；照相并统计带型。
[0041] 1.2. 3数据统计
[0042] 多态性标记统计方法为某位点若有条带记为'1'，若无则记为'0'。
[0043] 根据带型统计结果进行遗传多样性分析。使用NTSYS-pc Ver. 2. 10软件进行基于 UPGMA法的聚类分析。使用Picalc 0. 6软件计算各引物的PIC值（多态性信息量）。
[0044] 表1 20份用于核心引物筛选的材料
[0045]
【权利要求】
1. 一套萝卜EST-SSR核心引物组合，其特征在于，所述引物组合包括核苷酸序列，如序 列表SEQ ID No. 1?42所示引物。
2. 权利要求1所述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜品种遗传多样性分析中的 应用。
3. 权利要求1所述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜品种真伪性鉴别中的应 用。
4. 权利要求1所述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜杂种纯度鉴定中的应用。
5. 利用权利要求1所述的SSR核心引物组合进行萝卜品种资源遗传多样性评价分析的 方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 提取待测萝卜样品基因组DNA ; (2) 采用如序列表SEQ ID No. 1?42所示引物进行PCR扩增； (3) 将步骤（2)的扩增产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计 结果，某位置若有条带记为'1'，若无则记为'0' ； (4) 利用步骤（3)的统计结果进行遗传多样性分析。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)是采用CTAB小量法快速提 取待测萝卜样本基因组DNA，步骤为：选取适量植物组织（幼嫩叶片或下胚轴）置于2. OmL 离心管中；加入750 yl CTAB缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65°C水浴30小时，每隔10分钟 轻摇1次；冷却后加入750iU体积比为24 : 1的氯仿/异戊醇，上下混匀5分钟；12000rpm 离心15分钟；取上清液约500 ii 1，加入预先加好500 ii 1预冷异丙醇的2mL离心管中，轻轻 晃匀；4°C静止沉淀1小时；12000rpm离心15分钟，弃上清夜；加入300iU的75%乙醇洗 漆，自然晾干DNA ;加入100 yl的H20溶解DNA，-20°C保存备用。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)为：所述的引物核苷酸序 列如序列表SEQ ID No. 1?42所示；PCR反应条件是：15 ill的反应体系中含有1.5 ill 10父131^€61'(含]\%2+)，1.21112.51111(1阶13，川139〇嫩聚合酶，1〇11]\1551?上下游引物各加 0.5111，60叩模板0嫩；反应程序为，941：预变性4111111，然后941：308,551：308,721：458， 循环35次，72°C延伸4min后保存在KTC条件下。
8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)是使用NTSYS-pc Ver. 2. 10e 软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用PicalcO. 6软件计算各引物的PIC值。
【文档编号】C12Q1/68GK104450910SQ201410742889
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】张丽, 王庆彪 申请人:北京市农林科学院