一种枇杷自交亲和品种快速鉴定分子标记、标记引物及鉴定方法
【专利摘要】本发明属于分子标记领域，提供一种枇杷自交亲和Si分子标记，自交亲和标记引物和自交亲和品种快速鉴定方法。该Si分子标记序列如SEQ ID NO.1所示，大小为830bp，标记引物AS-PCR序列：正向引物如SEQ ID NO.2；反向引物如SEQ ID NO.3所示。鉴定方法以Si作为分子标记，以标记引物AS-PCR扩增不同枇杷品种DNA，筛选，可扩增出830bp片段的标志着Si分子标记的存在，说明该枇杷品种为自交亲和品种。本方法能快速鉴定枇杷自交亲和品种，不需要配置授粉树或进行人工授粉，可大大节约成本；不易受外界因素影响，精确度大，打破了传统方法的局限性，对提高枇杷的产量和品质有很大意义。
【专利说明】一种枇杷自交亲和品种快速鉴定分子标记、标记引物及鉴 定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子标记领域，涉及一种枇杷品种（系）自交亲和S-RNase基因型Si 分子标记，自交亲和标记引物和枇杷自交亲和品种快速鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 枇杷（Eriobotrya Lindl.)属配子体型自交不亲和 (Gametophyticself-incompati bility，GSI)，遗传上属于受单一位点（S-locus，S 位点） 的复等位基因（S-allele or S-gene，S基因）调控，当花粉的S等位基因与花柱中S等位 基因之一相同时，花粉管在花柱中的生长就会受到抑制，从而无法顺利完成受精作用而表 现出自交不亲和现象，严重影响果实产量。因此在栽培中必需配植合理的授粉品种或进行 科学的花期人工辅助授粉，方能获得稳定的产量与品质。这种方法虽然直观有效，但是不仅 费时费力，而且盲目性比较大，从而影响提高枇杷的品质。
[0003] 如果能找到自交亲和品种的枇杷，并能有效而快速地鉴定出来，就不需要配置授 粉树或进行人工授粉，可以大大地节约人工和生产成本，对提高枇杷的产量和品质有很大 的意义。
[0004] 枇杷自交亲和品种的鉴定是一项长期的应用基础性研究工作，随着新品种的不断 育成和推广，需要探索出一种可以快速鉴定出枇杷自交亲和品种的方法，这不仅能够为研 究枇杷自交不亲和性机理提供有益的试材，而且能够为生产提供切实的帮助。然而，从现有 的鉴定方法而言，主要是靠田间品种的套袋自交座果率高低来确定，虽然直观有效，但是工 作量大，周期长。
[0005] 在分子生物学领域，早在1952年，Lewis在月见草中发现了与特定S等位基因相 关的蛋白质，此后，有人从茄科等植物中发现含量丰富并与S位点遗传连锁的花柱糖蛋白。 近20年来，随着分子生物学的迅速发展，现已从多种配子体型植物中分离了近百个S核酸 酶。根据DNA和氨基酸序列比较的结果，发现它们与真菌RNaseRh和RNaseTZ同源，且含 有相同的活性部位，具有核酸酶活性，故而常称为S-核酸酶（S-RNase)。S-RNase -般为 250个氨基酸左右。比较S-RNase的蛋白质序列发现它们之间有数个保守区和两个高变区， 高变区Hva和Hvb多数为S -蛋白的亲水区域，可能与S-RNase的识别有关。保守区可能 与S-RNase的活性和结构有关。作为一类分泌型糖蛋白，S-RNase在雌蕊中特异表达，主要 分布在花柱传递组织的细胞间隙中，在花柱1/3以上部位的浓度最高，该部位正是自交不 亲和花粉生长受到抑制最强列的区域。在包围胚珠的胎座表皮细胞中检测到了低水平的 S-RNase的表达。由此可见，在花粉管进入胚珠必须通过的组织中均有S-RNase的表达，它 的分布位置与花粉管伸长的途径相一致。只有S-RNase的浓度达到一定的阀值，自交不亲 和才能发生，S-蛋白的表达量与花的发育过程显著相关。一般来说，S-RNase与S-位点共 分离本身并不能证明它一定是S基因产物，因为可能是与S基因紧密连锁基因的表达产物。 但是，目前已有有利证据证明S-RNase就是S位点在花柱中的产物。S-蛋白序列表现出高 度的差异性，这些序列的多态性为分子识别提供了可能。
[0006] 但是，目前对于通过鉴定品种的S基因型认识不同，并且检测设备、技术条件要求 高，使枇杷品种的自交亲和品种鉴定进展一直十分缓慢，因此，枇杷的自交亲和品种鉴定是 一个极其薄弱而又急待加强的研究领域。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中枇杷的自交亲和品种的鉴定时间长、技术薄弱等问题，本发明通 过提供一种枇杷品种（系）自交亲和S-RNase基因型Si分子标记、标记引物及枇杷自交亲 和品种快速鉴定方法，适用于枇杷自交亲和性（S基因型）品种（系）的鉴定、指导育种亲 本的选择。
[0008] 本发明的目的通过以下技术手段获得：
[0009] 1、本发明提供一种枇杷自交亲和品种快速鉴定分子标记，该分子标记为枇杷 S-RNase基因型Si,序列如SEQ ID NO. 1所示，大小为830bp。
[0010] 2、本发明还提供一种枇杷自交亲和品种快速鉴定分子标记引物，该标记引物 AS-PCR序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO. 2;反向引物序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 3、本发明还提供一种枇杷自交亲和品种快速鉴定方法，该鉴定方法以枇杷 S-RNase基因型Si作为分子标记，其序列如SEQ ID NO. 1所示；WSi分子标记引物：正向引 物序列如SEQ ID NO. 2;反向引物序列如SEQ ID NO. 3所示，进行筛选，AS-PCR扩增不同枇 杷品种DNA，可扩增出830bp的扩增片段，标志着枇杷S-RNase基因型S i的存在，说明该枇 把品种为自受未和品种。
[0012] 4、根据上述3提供的枇杷自交亲和品种快速鉴定方法，其中，25 μ L AS-PCR扩增 反应体系中含有10\卩〇?1311打6『2.5±0.25 4 1^2.5臟〇1*1^-1的(1阶138 2.0±0.2 4 1^ 2. 5mmol .L-I 的MgCl22. 0±0· 2μ L，IU Tap DNA聚合酶 1±0· 1 μ L，5pmol · μ L-I 的AS-PCR 上、下游引物1±〇. 1 μ L。
[0013] 5、根据上述3提供的枇杷品种自交亲和Si基因型AS-PCR分子标记鉴定方法， 其中，扩增热循环参数为：94°C预变性2min，然后94°C变性15s，55°C退火30s，70°C延伸 2min，共30个循环，最后70°C延伸7min。
[0014] 6、根据上述3提供的枇杷品种自交亲和Si基因型的AS-PCR分子标记鉴定方法， 其中，标记引物扩增产物经2 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0015] 有益效果：
[0016] 本发明通过试验研究获得了枇杷品种（系）自交亲和Si分子标记，以此分子标记 为基础，设计分子标记引物，快速鉴定枇杷自交亲和品种，不需要配置授粉树或进行人工授 粉，可以大大地节约人工和生产成本；同时，不易受外界环境和生育期等因素影响，鉴定精 确度大，误差小，打破了传统方法的局限性，对提高枇杷的产量和品质有很大的意义。对于 自交品种很少的枇杷来说，如果能快速鉴定出枇杷自交亲和，不仅可以减少选种时的盲目 性，获得高产量和优质品种，还能丰富枇杷的种质资源，为有效的分子鉴定方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1亲和品种和不亲和品种自交授粉72小时后花粉管的萌发状况荧光图
[0018] Α·上海种（亲和）自交授粉72h;B.白玉（不亲和）自交授粉72h
[0019] 图2利用AS-PCR引物对枇杷的Si基因型进行检测的电泳图
[0020] M为DNA Marker ;泳道1?13依次为枇杷品种：1红灯笼（S6Si)、2千禧佩玉（S6S i)、 3 解放钟（S11S31)、4 常绿 12 (S2S31)、5 东山鸡蛋白（S2S31)、6 串脑（S7S11)、7 白玉（S2S31)、8 霸 红（S31S31)、9 西山鸡蛋白（S31S11)、10 冰糖种（S7S11)、11 冠玉（S2S8)、12 丰玉（S2S2)、13 上海 种（S7Si)
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0022] 实施例1
[0023] 1.品种鉴定
[0024] 选取红灯笼、千禧佩玉、解放钟、常绿12、东山鸡蛋白、串脑、白玉、霸红、西山鸡蛋 白、冰糖种、冠玉、丰玉、上海种13个枇杷品种（江苏省太湖常绿果树技术推广中心提供，以 上品种面向社会开放）。
[0025] 用荧光显微镜法观察13个品种自交授粉72小时后花粉管的发状况来统计座果 率，以此判断品种是否为自交品种，如表1，通过自交授粉座果率可以看出红灯笼、千禧佩 玉、上海种为自交亲和品种，解放钟、常绿12、东山鸡蛋白、串脑、白玉、霸红、西山鸡蛋白、冰 糖种、冠玉、丰玉为自交不亲和品种。
[0026] 表1自交授粉座果率统计
[0027]
【权利要求】
1. 一种枇杷自交亲和品种快速鉴定分子标记，其特征在于：该分子标记为枇杷 S-RNase基因型Sp序列如SEQ ID NO. 1所示，大小为830bp。
2. -种枇杷自交亲和品种快速鉴定分子标记引物，其特征在于：该标记引物AS-PCR序 列如下：正向引物序列如SEQ ID NO. 2 ;反向引物序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. -种枇杷自交亲和品种快速鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法以枇杷S-RNase基 因型Si作为分子标记，其序列如SEQ ID NO. 1所示；分子标记引物：正向引物序列如 SEQ ID NO. 2;反向引物序列如SEQ ID NO. 3所示，进行筛选，AS-PCR扩增不同枇杷品种DNA， 可扩增出830bp的扩增片段，标志着枇杷S-RNase基因型Si的存在，说明该枇杷品种为自 受未和品种。
4. 权利要求3所述的枇杷自交亲和品种快速鉴定方法，其特征在于：25iiL AS-PCR扩 增反应体系中含有 10XPCR buffer 2. 5±0. 25ii L，2. 5mmol ? L-1 的 dNTPs2. 0±0. L， 2. 5mmol .L-l 的MgCl22. 0±0. L，1U Tap DNA聚合酶 1±0. 1 ii L，5pmol ? ii L-l 的AS-PCR 上、下游引物l±〇. 1 y L。
5. 权利要求3所述的枇杷自交亲和品种快速鉴定方法，其特征是：扩增热循环参数为： 94°C预变性2min，然后94°C变性15s，55°C退火30s，70°C延伸2min，共30个循环，最后70°C 延伸7min。
6. 权利要求3所述的枇杷自交亲和品种快速鉴定方法，其特征是：标记引物扩增产物 经2 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
【文档编号】C12N15/11GK104404156SQ201410742192
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】王三红, 汪茜 申请人:南京农业大学