榉树ssr2标记、引物对及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种榉树SSR2标记、引物对及其制备方法和应用，发明人利用特定引物对JS2对榉树总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列SSR2标记。该法简单易行、操作简便，得到的简单重复序列在三个榉树天然群体的居群内和居群间检测表明具有较高的多态性。榉树SSR2标记是共显性标记，较之其它分子标记，SSR标记重复性好、可靠性高，可应用于榉树的遗传多样性评价、榉树遗传图谱构建、榉树种群遗传变异空间分布格局和榉树起源进化的研究，以及目标基因的标定，还可应用于榉树的分子标记辅助育种和QTL研究。
【专利说明】榉树SSR2标记、引物对及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物科学中的分子标记【技术领域】，尤其涉及一种榉树SSR2标记、引物 对及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]棒树（ZelkovaschneiderianaHand. -Mazz.)为偷科（Ulmaceae)棒树属 (Zelkova)落叶大乔木，为我国特有种。榉树分布于我国淮河流域、秦岭以南的长江中下游 地区。榉树木材致密坚硬，材色鲜艳，纹理美观，耐腐性强，是生产各类高档家具和工艺品的 上等木材。同时，由于其树形优美，树冠冠幅大，叶色季相变化丰富，也是深受人们喜爱的传 统色叶园林风景树种。因榉树种子萌发率低，自然更新困难，而且频遭人类砍伐，故其野生 资源日渐稀少，已被列为国家二级重点保护植物。
[0003]SSR标记（Simple sequence repeat)，也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷 酸为重复单位组成的长达几十乃至数百个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色 体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了 SSR长度的高度变异 性，由此产生SSR标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的 单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺 凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。SSR标记具有以下优点：（1)标记数量 丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；（2)是共显性标记，呈孟德尔遗传；
[3] 技术重复性好，易于操作，结果可靠。
[0004] 尽管国内外的学者已经使用ISSR、RAro等多种标记研究了榉树群体的遗传多样 性，但是ISSR和RAro两种标记均为显性标记，稳定性差，且不能直接应用于分子标记辅助 育种和QTL定位。因此，研究榉树SSR标记、开发榉树的SSR引物很有必要。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种榉树SSR2标记、引物对及其制备方法和应 用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：榉树SSR标记，具有序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列，微卫星标记编号为SSR2。
[0007]扩增上述榉树SSR标记的引物对JS2，包括具有序列表SEQ.ID.No. 2和SEQ. ID.No.3的喊基序列。
[0008] 上述榉树SSR标记的制备方法，利用特定引物对JS2对榉树总DNA进行PCR扩增， 得到简单重复序列；引物对JS2包括具有序列表SEQ.ID.No. 2和SEQ.ID.No. 3的碱基序列。 [0009]上述榉树SSR标记的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 〈1>榉树总DNA提取与酶切
[0011] 选取榉树幼嫩的叶片，用CTAB法提取核基因组；用EcoRV在37°C下酶切3h，65°C 下20min灭活内切酶；反应体系20iiL，包括2. OiiL的10XBuffer，1.0iiL的EcoRV内切 酶,2 ii L的DNA，15. 0 ii L的灭菌双蒸水；
[0012] 〈2>接头的连接
[0013] 将步骤<1>EcoRV酶切的榉树基因组DNA连接上下接头；60ii L连接体系中含有酶 切的榉树基因组DNA 9 y L，上下接头各lOOpmol;连接反应在1倍T4连接酶缓冲条件下进 行，于16°C连接过夜；连接后的混合物在65°C反应20min，灭活连接酶；
[0014] 〈3>连接产物的扩增
[0015] 过夜步骤〈2>连接后的混合物以AP2和复合SSR引物为上下引物对连接后的混合 物进行PCR扩增；1. 5%的琼脂胶电泳，切胶回收500-1000bp的片段，试剂盒纯化；
[0016] 〈4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段
[0017] 将步骤<3>PCR产物连接到载体pMD18-TVectors上，然后转化到感受态JM109细 胞中，涂布到含有Amp的平板培养基上，37°C培养过夜；用M13引物进行PCR扩增检测，选取 400-1000bp左右的片段；
[0018] 〈5>测序、引物设计与扩增分析
[0019] 将步骤<4>PCR产物送测序；利用Primer5. 0软件对测序结果进行SSR引物设计并 送合成，得引物对JS2;利用引物对JS2在榉树基因组中扩增出片段SSR2标记。
[0020] 步骤〈2>中上下接头分别具有序列表SEQ.ID.No. 4和SEQ.ID.No. 5的碱基序列； 步骤〈3>中AP2和复合SSR引物分别具有序列表SEQ.ID.No.6和SEQ.ID.No.7的碱基序列； 步骤〈4>中M13引物对具有序列表SEQ.ID.No. 8和SEQ.ID.No.9的碱基序列；步骤〈5>中 引物对JS2分别具有序列表SEQ.ID.No. 2和SEQ.ID.No. 3的碱基序列。
[0021] 上述榉树SSR标记的制备方法，步骤〈3>中扩增按以下操作进行：
[0022] 扩增体系：反应体系50 ii L，包括30-50ng的模板DNA，0. 5个单位的DNA聚合酶 (TaKaRa)，1 X PCR Buf f er (含 MgCl2)，0? 2mM dNTPs,复合 SSR 引物和 AP2 引物各 0? 5mM ;
[0023] 扩增程序：94°C预变性9min，62°C复性30s，72°C延伸lmin，1个循环；94°C变 性3〇8,621：复性3〇8,721：延伸1111111，5个循环 ；941：变性3〇8,6〇1：复性3〇8,721：延伸 lmin, 35个循环；94°C变性30s，60°C复性30s, 72°C延伸9min, 1个循环。
[0024] 上述榉树SSR标记的制备方法，步骤〈5>中扩增按以下操作进行：
[0025] 扩增体系：反应体系lOuL，包括30-50ng的模板DNA，0. 25个单位的DNA聚合 酶（TaKaRa)，1. 0 ii L 的 lOXBuffer，2. 5mM MgCl2l y 1，2. 5mM dNTPsl y 1，0? 1 ii 1 bovine serum albumin(BSA)；
[0026]扩增程序：95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，52°C 复性 45s，72°C 延伸 lmin30s，30 个循环；最后72°C延伸10min。
[0027] 经过对榉树的深入研究，发明人利用特定引物对JS2对榉树总DNA进行PCR扩增， 得到简单重复序列SSR2标记。具体制备方法包括以下步骤：〈1>榉树总DNA提取与酶切； 〈2>接头的连接；〈3>连接产物的扩增；〈4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段；〈5>测序、 引物设计与扩增分析。该法简单易行、操作简便，得到的简单重复序列在三个榉树天然群体 的居群内和居群间检测表明具有较高的多态性。榉树SSR2标记是共显性标记，较之其它 分子标记，SSR标记重复性好、可靠性高，可应用于榉树的遗传多样性评价、榉树遗传图谱构 建、榉树种群遗传变异空间分布格局和榉树起源进化的研究，以及目标基因的标定，还可应 用于榉树的分子标记辅助育种和QTL研究。
【具体实施方式】
[0028] 实施例
[0029] 〈1>榉树总DNA提取与酶切
[0030] 选取榉树幼嫩的叶片，用CTAB法提取核基因组；用EcoRV在37°C下酶切3h，65°C 下20min灭活内切酶；反应体系20iiL，包括2. OiiL的10XBuffer，1.0iiL的EcoRV内切 酶,2 ii L的DNA，15. 0 ii L的灭菌双蒸水；
[0031] 〈2>接头的连接
[0032] 将步骤<1>EcoRV酶切的榉树基因组DNA连接上下接头（上接头序列GTAAT ACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT，序列表 SEQ. ID. No. 4 ;下接头序列 ACCAGCCC-NH2,序列表SEQ. ID. No. 5) ;60 ii L连接体系中含有酶切的榉树基因组DNA9 ii L， 上下接头各l〇〇pmol ;连接反应在1倍T4连接酶缓冲条件下进行，于16°C连接过夜；连接后 的混合物在65°C反应20min，灭活连接酶；
[0033] 〈3>连接产物的扩增
[0034] 过夜步骤〈2>连接后的混合物以AP2 (序列表SEQ. ID. No. 6)和复合SSR引物（序 列表SEQ. ID. No. 7)为上下引物对连接后的混合物进行PCR扩增；1. 5%的琼脂胶电泳，切胶 回收500-1000bp的片段，试剂盒纯化；
[0035] 扩增按以下操作进行：
[0036] 扩增体系：反应体系50 ii L，包括30-50ng的模板DNA，0. 5个单位的DNA聚合酶 (TaKaRa)，1 X PCR Buf f er (含 MgCl2)，0? 2mM dNTPs,复合 SSR 引物和 AP2 引物各 0? 5mM ;
[0037] 扩增程序：94°C预变性9min，62°C复性30s，72°C延伸lmin，1个循环；94°C变 性3〇8,621：复性3〇8,721：延伸1111111，5个循环 ；941：变性3〇8,6〇1：复性3〇8,721：延伸 lmin, 35个循环；94°C变性30s，60°C复性30s, 72°C延伸9min, 1个循环。
[0038] 〈4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段
[0039] 将步骤<3>PCR产物连接到载体pMD18-T Vectors上（Takara)，然后转化到感受态 JM109细胞中，涂布到含有Amp的平板培养基上，37°C培养过夜；用M13引物（M13F和M13R， 序列表SEQ. ID. No. 8和SEQ. ID. No. 9)进行PCR扩增检测，选取400-1000bp左右的片段；
[0040] 〈5>测序、引物设计与扩增分析
[0041] 将步骤<4>PCR产物送至上海英骏生物技术有限公司测序；利用Primer5. 0软件 对测序结果进行SSR引物设计并送上海英骏生物公司合成，得引物对JS2 (序列表SEQ. ID. No. 2和序列表SEQ. ID. No. 3);利用引物对JS2在榉树锥基因组中扩增出片段SSR2标记 (序列表 SEQ. ID. No. 1)。
[0042] 扩增按以下操作进行：
[0043] 扩增体系：反应体系10iiL，包括30-50ng的模板DNA，0. 25个单位的DNA聚合 酶（TaKaRa)，1. 0 ii L 的 lOXBuffer，2. 5mM MgCl2l y 1，2. 5mM dNTPsl y 1，0? 1 ii 1 bovine serum albumin(BSA)；
[0044] 扩增程序：95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，52°C 复性 45s，72°C 延伸 lmin30s，30 个循环；最后72°C延伸10min。
[0045] 〈6>多态性分析
【权利要求】
1. 一种榉树SSR标记，其特征在于具有序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列，微卫星标记编 号为SSR2。
2. 扩增权利要求1所述榉树SSR标记的引物对JS2,其特征在于包括具有序列表SEQ. ID. No. 2 和 SEQ. ID. No. 3 的碱基序列。
3. 权利要求1所述榉树SSR标记的制备方法，其特征在于利用特定引物对JS2对榉树 总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；所述引物对JS2包括具有序列表SEQ. ID. No. 2和 SEQ. ID. No. 3的喊基序列。
4. 根据权利要求3所述榉树SSR标记的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 〈1>榉树总DNA提取与酶切 选取榉树幼嫩的叶片，用CTAB法提取核基因组；用EcoRV在37°C下酶切3h，65°C下 20min灭活内切酶；反应体系20 ii L，包括2. 0 ii L的lOXBuffer，1. 0 ii L的EcoRV内切酶， 2 ii L的DNA，15. 0 ii L的灭菌双蒸水； 〈2>接头的连接 将步骤<1>EcoRV酶切的榉树基因组DNA连接上下接头；60 ii L连接体系中含有酶切的 榉树基因组DNA 9iiL，上下接头各lOOpmol ;连接反应在1倍T4连接酶缓冲条件下进行，于 16°C连接过夜；连接后的混合物在65°C反应20min，灭活连接酶； 〈3>连接产物的扩增 过夜步骤〈2>连接后的混合物以AP2和复合SSR引物为上下引物对连接后的混合物进 行PCR扩增；1. 5%的琼脂胶电泳，切胶回收500-1000bp的片段，试剂盒纯化； 〈4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段 将步骤<3>PCR产物连接到载体pMD18-T Vectors上，然后转化到感受态JM109细胞 中，涂布到含有Amp的平板培养基上，37°C培养过夜；用M13引物进行PCR扩增检测，选取 400-1000bp左右的片段； 〈5>测序、引物设计与扩增分析 将步骤<4>PCR产物送测序；利用Primerf. 0软件对测序结果进行SSR引物设计并送合 成，得引物对JS2 ;利用引物对JS2在榉树基因组中扩增出片段SSR2标记。
5. 权利要求4所述榉树SSR标记的制备方法，其特征在于： 步骤〈2>中上下接头分别具有序列表SEQ. ID. No. 4和SEQ. ID. No. 5的碱基序列； 步骤〈3>中AP2和复合SSR引物分别具有序列表SEQ. ID. No. 6和SEQ. ID. No. 7的碱基 序列； 步骤〈4>中M13引物对具有序列表SEQ. ID. No. 8和SEQ. ID. No. 9的碱基序列； 步骤〈5>中引物对JS2分别具有序列表SEQ. ID. No. 2和SEQ. ID. No. 3的碱基序列。
6. 权利要求5所述榉树SSR标记的制备方法，其特征在于步骤〈3>中扩增按以下操作 进行： 扩增体系：反应体系50 ii L，包括30-50ng的模板DNA，0. 5个单位的DNA聚合酶 (TaKaRa)，1 X PCR Buf f er (含 MgCl2)，0? 2mM dNTPs,复合 SSR 引物和 AP2 引物各 0? 5mM ; 扩增程序：94°C预变性9min，62°C复性30s，72°C延伸lmin，1个循环；94°C变性30s， 62°C复性 30s，72°C延伸 lmin，5 个循环；94°C变性 30s，60°C复性 30s，72°C延伸 lmin，35 个 循环；94°C变性30s，60°C复性30s, 72°C延伸9min, 1个循环。
7. 权利要求5所述榉树SSR标记的制备方法，其特征在于步骤〈5>中扩增按以下操作 进行： 扩增体系：反应体系10 ii L，包括30-50ng的模板DNA，0. 25个单位的DNA聚合酶 (TaKaRa)，1.0iiL 的 10XBuffer，2.5mM MgCl2liil，2.5mM dNTPsliil，0.1iil bovine serum albumin(BSA)； 扩增程序：95°C预变性5min ;95°C变性30s，52°C复性45s，72°C延伸lmin30s，30个循 环；最后72°C延伸lOmin。
8. 权利要求1所述榉树SSR2标记在榉树的分子标记辅助育种方面的应用。
9. 权利要求1所述榉树SSR2标记在榉树的QTL研究方面的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104450692SQ201410679880
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】张日清, 汪灵丹, 金晓玲, 刘海龙 申请人:中南林业科技大学