专利名称：一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物。
背景技术：
小麦叶锈病(Puccinia triticina f. sp. tritici)是一种世界性病害，条件 适宜时可造成40%甚至更大的产量损失(摘自Knott D R. The wheat rust breeding forresistance. Monographs on Theoretical and Applied Genetics, 1989)。在我国，小麦 叶锈病过去主要在西南及长江流域的部分地区，如贵州、江西等省发生较重，近年来华北、 西北及东北各地的发生也日趋严重。利用抗叶锈品种是减轻叶锈病危害的经济、有效、快捷 的方法。加强小麦品种及其遗传资源的抗病性研究，对病害的持续控制、确保小麦安全生产 至关重要。目前已有60余个抗叶锈病基因正式命名(Mcintosh et al. Catalogue of gene symbols for wheat 2007 supplement[DB/0L]. [2008-01-30]http://shigen. lab. nig. ac. jp//wheat/komugi/top/top. jsp)，由于叶锈菌大多数具有生理专化性，这些抗病基因 往往会由于病菌小种的变异而很快“丧失”抗性。因此利用多基因聚合、基因布局和多系品 种来延长抗病基因的抗性寿命是一重要手段。然而，我国由于缺少对生产品种中抗叶锈基 因的全面分析，对使用品种的抗病性的了解不够全面，往往造成小麦品种的盲目推广使用， 加上小麦叶锈菌新毒性基因的产生致使抗病品种不断丧失抗病性，小麦叶锈病发生日趋严 重。因此，了解目前生产品种的抗叶锈性及其基因、发掘新的抗源成为有效控制该病害的一 个重要环节。在人类基因组研究的推动下，分子标记的研究与利用得到了迅速的发展并用于作 物种质资源和育种的研究，特别是在构建分子遗传图谱和标记目的性状基因方面取得了很 大的进展。寻找与重要农艺性状基因紧密连锁的分子标记，是进行分子标记辅助选择和育 种的基础。近年来，利用分子标记包括RAPD、RFLP、AFLP、SSR和TRAP等定位和标记了多个 小麦抗叶锈病基因。AFLP标记呈典型的孟德尔方式遗传，多态性高，稳定性好，可在短时间 内对大量的DNA样品进行检测，非常适合遗传多样性分析、种质鉴定、基因定位和快速构建 遗传图谱等研究。但由于其检测过程涉及聚丙烯酰胺凝胶电泳的使用，对技术要求高且工 作量大，将在基因组随机分布的AFLP标记转化为STS标记则可为分子辅助育种提供方便、 快捷的检测手段。Lr24抗叶锈病基因来源于长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum, 2n = 70)，目前很 少有对该基因表现有毒力的小麦叶锈菌，因此是非常具有应用潜力的抗病基因。通过对 Lr24进行AFLP分析，找到了与该基因紧密连锁的分子标记，并转化为稳定的STS标记，用于 标记辅助育种。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的引物。本发明的另一个目的是提供一种可用于筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法。
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本发明所提供的用于筛选Lr24抗病基因的引物，是由序列表中的序列1和序列2 的核苷酸序列组成的引物对。将由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对命名为A-S24，序列表中 SEQ ID No :1和SEQ ID No :2均由20个碱基组成，将用引物对A-S24经PCR扩增到得到的 分子标记命名为TA-S24。本发明所提供的筛选含抗叶锈病基因Lr24的小麦的方法，是以待测小麦品种基 因组DNA为模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物A-S24的引导下 进行PCR扩增，扩增产物中有212bp大小条带的小麦品种为含Lr24基因的小麦。其中，20. OyL PCR反应体系为模板DNA 50ng，Taq酶IU(TaKaRa)，上、下游引物 (5ymol · Γ1)各 1.0 μ L，dNTP(IOmmol · Γ1)。· 5 μ L，10XPCR 缓冲液 2· 0 μ L，其余用无菌 蒸馏水补充反应体系至20.0 μ L。反应程序为94°C预变性3min，随后进行35个循环94°C 变性 lmin，60°C退火 lmin，72°C延伸 Imin ；最后 72°C延伸 lOmin，10°C保存。所述检测扩增产物的方法可为对扩增产物进行2. 0%琼脂糖凝胶电泳，然后用EB 或Goldview显色。具体方法为取5μ L扩增产物，加入0.5μ L变性载样指示剂(98%无 离子甲酰胺，IOmM EDTA ρΗ8. 0,0. 25%溴酚蓝)，在浓度为2. 0%的琼脂糖凝胶中电泳分离。 检测扩增产物中是否有212bp大小的条带。本发明提供了一个与小麦抗叶锈病基因Lr24共分离的AFLP-STS标记TA-S24， Lr24基因对我国目前流行的大多数叶锈菌小种表现抗病。利用与该抗病基因共分离的分子 标记可以对其进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。 本发明的小麦抗叶锈病基因Lr24的专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为用A-S24引物抗感亲本和F2群体单株的PCR扩增结果。图2为用A-S24引物对已知含有Lr24抗叶锈病基因Lr24的小麦品种的PCR扩增结果。图1中R 抗病F2单株；S 感病F2单株24、Tc分别代表抗病亲本和感病亲本。图 2中1、9、10、19、20、29、35、37、44 相应的近等基因系；N1-N5 :5个小麦品种，依次为鄂恩1 号、5R625、周 19、1R13、1R17 ；M :DL2000Marker。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，引物由上海生工生物工程公 司合成。小麦近等基因系、TCLr24XThatCher杂交后代及小麦品种等植物材料均由河北农 业大学小麦叶锈病研究中心收集保存。实施例1、小麦抗叶锈病基因Lr24 AFLP-STS标记的获得用对小麦抗叶锈病基因Lr24低毒，对感病亲本Thatcher高毒的小麦叶锈菌单孢 菌系(BGQQ和SHRT)对TcLr24和Thatcher杂交的F1和F2代群体进行苗期抗叶锈性鉴定， 共鉴定F1群体10株，F2群体141株，结果F1全部抗病，F2抗感符合3 1分离比例，如表 1所示，表明TcLr24对BGQQ和SHRT的抗性由显性单基因控制。
表1 TcLr24 X Thatcher F2群体对叶锈菌菌系BGQQ及SHRT抗感分离
权利要求
一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的专用引物，其特征在于，是由序列表中的序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。
2.一种筛选含抗叶锈病基因Lr24的小麦的方法，其特征在于，是以待测小麦品种基因 组DNA为模板，在由权利要求1所述的序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对 的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有212bp大小条带的小麦品种为含Lr24基因的小麦。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，20μ L PCR反应体系为模板DNA 50ng, Taq酶1U，上、下游引物各1. 0 μ L，dNTPO. 5 μ L，10XPCR缓冲液2. 0 μ L,其余用无菌蒸馏水 补充反应体系至20. 0μ L ；反应程序为94°C预变性3min，随后进行35个循环94°C变性 lmin，60°C退火 lmin，72°C延伸 Imin ；最后 72°C延伸 lOmin，10°C保存。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述检测扩增产物的方法可为对扩增 产物进行2. 0%琼脂糖凝胶电泳，然后用EB或Goldview显色。
全文摘要
本发明公开了一种筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物，专用引物是由序列表中的序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。筛选含抗叶锈病基因Lr24的小麦的方法，是以待测小麦品种基因组DNA为模板，在由权利要求1所述的序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，扩增产物中有212bp大小条带的小麦品种为含Lr24基因的小麦。所述检测扩增产物的方法可为对扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，然后用EB或Goldview显色。本发明的筛选小麦抗叶锈病基因Lr24的方法及其专用引物将在小麦叶锈病抗病育种中发挥重要作用。
文档编号C12Q1/68GK101967518SQ20101018643
公开日2011年2月9日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者刘大群, 孟庆芳, 张娜, 张汀, 张立荣, 李在峰, 李星, 杨文香, 王海燕, 闫红飞 申请人:河北农业大学