小麦TaPPDK1蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及小麦TaPPDKI蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 据估计，全球有超过6%的±地和近20%的耕地受到盐胁迫的影响，±壤的盐碱 化问题日益威胁着人类赖W生存的有限±地资源。农作物绝大部分品种是盐敏感的，±壤 盐溃化阻滞作物生长导致减产甚至绝收。培育耐盐性作物品种具有成本低、见效快、长远持 久的特点，是提高盐溃±壤作物产量水平和经济效益的有效方法。而耐盐基因的挖掘及耐 盐种质的创制是耐盐育种的重要保障。小麦作为世界上分布最广、种植面积最大、加工制品 最为丰富的粮食作物之一，其农业地位的重要性不可忽视。然而由于非生物胁迫应答是由 多基因控制的复杂性状，且小麦作为异源六倍体，小麦耐盐基因挖掘及耐盐分子机理的研 究仍然进展缓慢。研究表明植物丙酬酸憐酸双激酶（pyruvateorthophosphatedAinase， PPDK;EC2. 7. 9. 1)是C4光合途径中一个非常重要的限速酶，但其在植物抵御逆境胁迫中 的作用尚不清楚，在小麦中更是空白。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供小麦TaPPDKI蛋白及其编码基因。
[0004] 本发明提供的蛋白，命名为TaPPDKI,是如下1)或2):
[0005] 1)序列表中序列2所示的蛋白质；
[0006] 2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
[0007] 上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸 残基的取代和/或缺失和/或添加。
[000引编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0009] 上述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：
[0010] 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
[0011]。编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；
[001引 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的 DNA分子；
[001引 4)与1)或。限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 % 或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
[0014] 上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0015]含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0016] 扩增上述DM分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
[0017] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控 植物抗逆性中的应用也是本发明保护的范围。
[0018] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育 高抗逆性植物中的应用也是本发明保护的范围。
[0019] 上述应用中，上述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性；
[0020] 所述抗逆性为抗盐性；
[0021] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0022] 或所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。
[0023] 本发明的另一个目的是提供一种培育具有高抗逆性转基因植物的方法，为将编码 上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的抗逆性高于所述 目的植物。
[0024] 上述方法中，所述抗逆性为抗盐性；
[00巧]所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0026] 或所述植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。
[0027] 本发明的实验证明，本发明在小麦中发现蛋白TaPPDKl，将该蛋白对应的基因在拟 南芥中过表达，转基因植物的抗盐性高于野生型对照，验证了该基因具有提高植物抗盐性 的功能，为培育抗盐植物提供候选基因。
【附图说明】
[0028] 图1为盐胁迫条件下小麦根（Root)和叶片化eaf)中PPDK在基因表达及酶活性 方面的变化。
[0029] 图2为TaPPDKl转化拟南芥的表达载体构建。
[0030] 图3为TaPPDKl基因Pg巧gus-plus载体的构建及鉴定。
[0031] 图4为35S:TaPPDKl转基因拟南芥纯系TaPPDKlmRNA表达量检测。
[0032] 图5为盐胁迫下野生型和转基因拟南芥株系的萌发（A)和相对萌发率度）。
[0033] 图6为野生型和35S:TaPPDKl株系在盐胁迫下根长测量。
[0034] 图7为在盐胁迫下野生型和3个转基因株系幼苗表型（A)及存活率度）。
[0035] 图8为在盐胁迫下野生型和3个转基因株系苗期表型（A)及盐胁迫第7天叶绿素 含量度）。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 小麦材料为济麦19 (记载在如下文献中：宋建民，刘建军，刘爱峰，李豪圣，吴祥 云，赵振东。济麦19面团流变学和淀粉特性与面条品质分析，麦类作物学报，2004,24(1): 15-17)幼苗，正常及350mM化C1胁迫培养3天。
[0039] 拟南芥生态型为Col-0型，种子消毒后播种于培养基上，幼苗移栽到穴盘后放入 人工培养室中培养，培养条件为相对湿度80 %，溫度20~24°C，光照强度80~200μmol/ (m2 ·s)，光周期为1化光照和化黑暗。
[0040] 大肠杆菌菌株为D册α农杆菌菌株为GV3101。
[0041] 实施例1、TaPPDKl基因的发现及克隆
[0042] 1、TaPPDKl基因克隆
[0043] 取盐胁迫及正常培养的小麦幼苗，通过iTRAQ shotgun蛋白质组学的方法比较二 者蛋白表达差异，RNA-seq方法比较二者基因表达差异。
[0044] 根据蛋白质组学方法找到的盐胁迫下差异表达蛋白Q7XYB5(Pyruvate orthophosphated化inase)的网上蛋白序列，在NCBI上找到其对应的部分cds序 列，基因编号AF475130. 1，再在NCBI上找到包含AF475130. 1序列在内的AK333343. 1 序列。在此序列中设计引物：Q7XYB5-CF:5' -ATGCCGTCGGTTTCGAG-3' ；Q7XYB5-CR: 5'-TCAGACAAGGACCTGGGCT-3' 〇
[0045]W济麦19的根的cDNA为模板，用上述引物Q7XYB5-CF和Q7XYB5-CR进行PCR扩 增，得到2820bp的PCR扩增产物。
[0046] 电泳检测PCR产物，回收目的片段并连接到pGEM-Teasy载体（Promega公司），阳 性克隆送上海生工测序，PCR扩增产物具有序列表中序列1所示的核巧酸，该PCR扩增产物 所示的基因命名为TaPPDKl,序列1为该基因的cDNA，将其编码的蛋白命名为TaPPDKl,该蛋 白的氨基酸序列命名为序列2。
[0047]W济麦19根的基因组DNA为模板，用表1所示的引物进行扩增；利用DNAStar软 件对获得的序列进行拼接和初步分析，得到TaPPDKl基因组DNA，经过测序，其核巧酸序列 为序列3。
[0048] 表1为TaPPDKl基因组序列扩增引物序列
[0049]
[0050]
[0051] 2、TaPPDKl基因表达分析
[0052]W正常及盐胁迫下小麦根和叶cDNA为模板，进行RT-PCR检测，分析TaPPDKl基 因表达变化情况。引物：RT-F:5' -CAGGCTTGGTATTTCGTATCC-3' ；RT-R:5'-CCAGCTTTGTAATC AATGGTTTT-3'。W小麦Actin基因为内参，引物Actin-f:5' -GGAAAAGTGCAGAGAGACACG-3'， Actin-r:5'-TACAGTGTCTGGATCGGTGGT-3'。
[0053] 结果如图1所示，JN:济麦19正常培养条件JS:济麦19盐胁迫培养条件；A:半定 量RT-PCR(引物RT-F和RT-R);B:巧光定量RT-PCR(引物RT-F和RT-R);C:PPDK酶活性分 析；可W看出，正常条件下，在小麦根和叶片中表达量很低，而在盐胁迫条件下显著上调表 达（图1A，B);且盐胁迫下，小麦根中的PPDK酶活性显著升高（图1C)，但是在叶片中PPDK 酶活性变化不大（图1C)。
[0054] 实施例2、TaPPDKl基因的功能验证
[0055] -、基因植物表达载体的构建
[0056] 根据TaPPDKl基因序列和表达载体pGFPGUS的多克隆位点特征，将载体上GUS切 掉，并设计添加酶切位点BglII和化1I的引物，
[0057] PPDK-BamHI-CF:5' -gaagatcttcATGCCGTCGGTTTCGAG-3'；
[0058] PPDK-Xbal-CR:5' -gtgTCAGACAAGGACCTGGGCT-3'。
[0059]W济麦19根cDNA为模板，用PPDK-BamHI-CF和PPDK-Xbal-CR为引物进行PCR扩 增，得到2833bp的PCR产物，为基因TaPPDKl。
[0060] 将序列1所示的基因TaPPDKl替换掉pGFPGUS载体（王敏娟，侯文胜，王庆佳， 等.过表达GmNHXl基因提高大豆根系的耐盐性.大豆科学，2011，30 (06) :889-894 ;公众 可从中国农业科学院作物科学研究所获得）的BglII和化1I酶切位点间的GUS基因得到 的载体，命名为TaPPDKl:Pg巧gus，为基因植物表达载体，由35S启动子驱动TaPPDKl基因的 表达（图2)。
[0061] 二、转TaPPDKl拟南芥的制备与验证
[0062] 将上述重组载体TaPPDKl:Pg巧gus转入农杆菌GV3101中，得到重组菌GV3101/ TaPPDKl:Pgfpgus。
[006引BglΠ和化1I酶切验证重组菌，结果如图3所示，Μ:DL2000marke;r，1-7 :挑取不 同单菌落PCR扩增结果，8 :阴性对照，得到2000bp的为阳性重组菌。
[0064]将上述阳性重组菌GV3101/TaPPDKl:Pg巧gus采用农杆菌介导法转化