一种利用搅拌式生物反应器生产传染性法氏囊病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种利用搅拌式生物反应器生产传染性法氏囊病毒的方法。
【背景技术】
[0002]传染性法氏囊病(Infect1us Bursal Disease，IBD)是由双RNA病毒科，禽双RNA病毒属的传染性法氏囊病毒(Infect1us Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种高度接触性传染病。本病主要侵害鸡的体液免疫中枢器官法氏囊等淋巴组织，对养禽业的危害主要包括两个方面。一方面是疾病本身可以造成3周龄或更大的雏鸡临床发病或死亡；另一方面可以对鸡体产生长期的免疫抑制，引起继发其它疾病(主要是鸡马立克、新城疫，大肠杆菌病、沙门氏菌病等)，致使死亡率明显升高，可达80%以上，给养禽业带来严重的经济损失。
[0003]预防该病主要通过接种疫苗来实现，其中灭活疫苗占了很大的比例。目前我国体外培养传染性法氏囊病毒的方法主要是利用鸡胚增殖或细胞系于转瓶培养两种方法。这种方法劳动强度大，耗时长，效率低，生产成本高；不同生产批次间或同一生产批次不同转瓶间的差异大，产品质量不稳定，难以扩大生产；容易被环境污染，常出现细菌或其它病毒的污染从而导致疫苗质量存在隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。采用规模化的生物反应器有望改善上述缺陷，然而由于不同细胞株、毒株具有完全不同的生物学特性，因此在利用生物反应器执行传染性法氏囊病毒制备的过程中缺乏一种普遍性的操作方法，也就是说，针对不同细胞株、毒株需要设计特定的培养条件。此外，相对于转瓶培养而言，生物反应器培养传染性法氏囊病毒的规模较大，可控参数较多，因此如何在此规模基础上保证细胞的增殖速率、病毒的效价，现有技术中尚未形成有效方法。
[0004]目前动物细胞生物反应器的种类较多，对于DF1细胞的培养，目前国内已有单位采用激流式生物反应器完成了大规模生产。但由于激流式生物反应器的特殊结构，它只能利用纸片载体进行培养，采用的是一次性生物耗材，易造成浪费，更重要的是在细胞培养过程中，不能随时观察细胞的状态，难以灵活掌控最佳接毒时间。与激流式生物反应器相比，搅拌式生物反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，易于清洗和消毒，可以重复和长期使用。它采用应用最广泛的微载体作为培养载体，可以随时取样，观察细胞状态，绘制生长曲线，准确掌握最佳接毒及收毒时间，得到最高滴度的病毒液。因此，在大规模细胞培养中占有重要位置，目前国内外有很多的相关研究和应用。
【发明内容】
[0005]本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种利用搅拌式生物反应器生产传染性法氏囊病毒的方法，以解决现有技术中相关方法自动化程度低、质量不稳定的技术问题。
[0006]本发明要解决的另一技术问题是现有技术的相关方法所生产的传染性法氏囊病毒效价较低。
[0007]本发明要解决的再一技术问题是现有技术的相关方法安全性较低。
[0008]本发明要解决的又一技术问题是利用生物反应器生产传染性法氏囊病毒时如何保证质量稳定。
[0009]本发明要解决的又一技术问题是利用生物反应器生产传染性法氏囊病毒时如何提升疫苗效价。
[0010]为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案:
[0011]—种利用搅拌式生物反应器生产传染性法氏囊病毒的方法，包括以下步骤:
[0012]1)在搅拌式生物反应器内，将灭菌后的微载体以3?6g/L的用量与无菌细胞生长液混合，得到混合培养基，向其中接种DF1细胞的密度为0.6?1.2 X 106个/ml,使DF1细胞在微载体上吸附培养，培养温度36?37°C、pH7.2?7.3、溶氧40?60%、搅拌速度30?80rpm ；
[0013]2)接种DF1细胞48?72h后，弃去混合培养基中的细胞生长液，加入细胞维持液，接入0.3?1.2M0I的传染性法氏囊病毒，继续培养；
[0014]3)接种病毒24?48h后，收获病毒液。
[0015]作为优选，步骤1)中混合培养基总体积是搅拌式生物反应器总容积的40?60%。
[0016]作为优选，步骤1)中接种细胞前反应器先搅拌20?60min。
[0017]作为优选，步骤1)种所述微载体是通过以下方法灭菌的:
[0018]A)以PBS缓冲液对微载体浸泡4h以上；
[0019]B)将步骤A)浸泡后的微载体用PBS缓冲液清洗；
[0020]C)将步骤B)清洗后的微载体在PBS缓冲液浸泡条件下115?125°C灭菌25?35min。
[0021]作为优选，步骤1)中用于接种的DF1细胞先经EDTA-胰酶消化液消化，而后再接种；在此基础上进一步优选的，所述Η)ΤΑ-胰酶消化液是含有0.03?0.05% (w/v)的胰酶和 0.02% (w/v)EDTA 的 PBS 缓冲液。
[0022]作为优选，步骤1)细胞生长液中含有90% (v/v)的DMEM/F12培养基和10% (v/V)的新生牛血清；在此基础上进一步优选的，在向所述细胞生长液接种DF1细胞前，先向细胞生长液中加入青霉素钠和硫酸链霉素，至青霉素钠终含量100IU/mL、硫酸链霉素终含量100IU/mLo
[0023]作为优选，步骤2)中弃去混合培养基中的细胞生长液时DF1细胞对微载体表面的占据率高于85%，微载体的空球率低于5%。
[0024]作为优选，步骤3)中收获病毒液时病毒效价达到最高。
[0025]作为优选，所述微载体是Cytodex系列微载体。
[0026]在以上技术方案中，用于接种的病毒毒种可以是通过以下方法制备的:用病毒培养液将传染性法氏囊病毒种毒按Μ0Ι量为0.3-1.2接种到单层传代细胞中进行培养，至接毒后24-48h，当毒价最高时，收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID5。和无菌检测，传至病毒TCID 5。稳定且达到10&5TCID5Q/mL以上时停止复壮，作为生产用种毒。其中，所述病毒培养液的优选配方为:98% DMEM/F12、2%新生牛血清、终浓度为100U/ml青霉素钠和硫酸链霉素，pH值为7.2-7.3ο
[0027]在以上技术方案中，所述空球率是指微载体上未被细胞附着的表面积占微载体总表面积的比例，该指标用于评价细胞在微载体上的贴附生长状况。所述DF1细胞是一种可传代的鸡胚成纤维细胞系，可自市面购得。所述Cytodex系列微载体，仅限定于由GE公司出品的、型号为Cytodex的一系列微载体产品。
[0028]本发明利用了搅拌式生物反应器操作范围较大、混合性良好以及浓度均匀等优点，通过搅拌作用提升培养液质传效果，确保培养液的养分和溶氧浓度的均匀分布，达到大规模培养细胞的目的。和其他生物反应器相比，其结构简单、成本较低。
[0029]本发明具有如下有益效果:
[0030](1)用生物反应器微载体细胞培养技术替代传统的转瓶细胞培养技术生产传染性法氏囊病毒疫苗，可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低的问题，通过生产技术和生产工艺的改变，提高病毒单位培养效价10-100倍，大大降低生产成本，全面提升疫苗质量和产量，提高疫苗的安全性。
[0031](2)与激流式生物反应器相比，搅拌式生物反应器混合均匀、结构简单、操作方便、有良好的传递效果和操作弹性，能实时掌握细胞生长状态，更易掌握病毒液最佳收获时间，提高疫苗效价。
[0032](3)低污染:本发明用细胞系代替原代细胞或者鸡胚组织培养传染性法氏囊病毒，可解决鸡胚自身及受外源病毒污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹。
[0033](4)生产工艺可控:高精密培养、实时监测溶氧、产气、残糖、PH、细胞状态等，综合参数设定培养曲线，直接保证载体细胞的状态；生产批量大、批间差异小；节省空间、人力和物力。
【具体实施方式】
[0034]以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0035]以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10%)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0036]除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
[0037]以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0038]实施例1
[0039](1)选择生物反应器作为培养的手段:10L德国sartorius stedim生物反应器。
[0040]⑵选择微载体作为细胞贴附生长的载体:微载体Cytodex 1。
[0041](3)微载体的清洗、灭菌方法:1)称量Cytodexl微载体3g/L，用1L PBS常温过夜浸泡微载体；2)用1L PBS清洗3遍；3)用1L PBS浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌30min。
[0042](4)选择DF1细胞作为制苗用细胞。
[0043](5)制苗用细胞的传代与培养:上述细胞经EDTA-胰酶(含0.03%胰酶、0.02%EDTA的PBS)消化传代，用含90% DMEM/F12培养液、10%新生牛血清、100IU/mL的青霉素钠和硫酸链霉素，pH值调整为7.2的细胞生长液继续培养。培养温度为37°C，形成良好单层时，接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。
[0044](6)细胞毒种的繁殖:用病毒培养液(含新生牛血清2%的DMEM/F12培养液、终浓度为100IU/mL的青霉素钠和硫酸链霉素，将传染性法氏囊病毒HQ株的种毒按Μ0Ι量为0.6接种生长良好的上述细胞单层，继续培养，培养温度为37°C。至接毒后40h即毒价最高时收获病毒液；测定病毒的TCID5。，待病毒效价稳定且达到10&5TCIDM/mL以上时停止复壮，将该病毒作为生产用种毒。
[0045](7) DF1细胞在搅拌式生物反应器中的微载体悬浮培养:取转瓶上生长良好的DF1细胞，用pH值为7.2的PBS清洗两遍，加入前述的EDTA-胰酶消化液消化，待细胞层开始出现整片脱落，加入所述的细胞生长液，吹悬制成细胞悬浮液，细胞计数密度按0.8X 106个/mL接种反应器中。生物反应器设定如下参数:温度37°C、pH值7.2、搅拌速度40rpm、溶氧含量40 %进行反应器自动控制