生物反应器及其搅拌桨和使用其培养cik细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养CIK细胞的方法。所述搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料，所述生物反应器含有其外包裹减小剪切力材料的搅拌桨，使用该生物反应器培养CIK细胞。本发明使用生物反应器培养CIK细胞，在搅拌桨外包裹可以减小剪切力的材料，可以降低细胞受到的剪切力伤害，有利于细胞大量扩增。本发明培养过程中不停的搅拌，为动态系统，有利于细胞进行气体交换和为细胞提供均一的培养环境，有利于细胞大量扩增。本发明方法不仅可以大量扩增CIK细胞，而且所得CIK细胞表面抗原表达量较高，对肿瘤细胞的杀伤活性较强。
【专利说明】
生物反应器及其搅拌桨和使用其培养Cl K细胞的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养 CIK细胞的方法。
【背景技术】
[0002] CIK细胞(cytokine-induced killer，细胞因子诱导的杀伤细胞)是将人外周血单 个核细胞(？811〇在体外用多种细胞因子(抗0^(^、11-2、正^丫、几-1€ [等)共同培养一段 时间后获得的一群异质细胞。CIK细胞被称为NK样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤 活性和NK细胞的非MHC(主要组织相容性复合体）限制性杀瘤优点，其主要效应细胞是CD3+ ⑶56+细胞。
[0003] CIK细胞能够通过以下三种途径杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞：
[0004] ① CIK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的直接杀伤:CIK细胞可以通过不同的机制 识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞裂解。
[0005] ②CIK细胞释放的大量炎性细胞因子具有抑瘤杀瘤活性:体外培养的CIK细胞可以 分泌多种细胞因子，如IFN- y、TNF_a、IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过 调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。
[0006] ③CIK细胞能够诱导肿瘤细胞的凋亡:CIK细胞在培养过程中表达FasL( II型跨膜 糖蛋白），FasL通过与肿瘤细胞膜表达的Fas(I型跨膜糖蛋白）结合，诱导肿瘤细胞凋亡。
[0007] 由于CIK细胞具有可以全身性治疗肿瘤，并且对人体无明显副作用，治疗无明显疼 痛感等优势，CIK细胞治疗被广泛应用于临床治疗，并取得良好效果。CIK细胞治疗技术是目 前最有效、最安全的辅助治疗方法。如今，很多实验室和医院CIK细胞治疗中使用的CIK细胞 大多数为小规模培养获得，具体方法为:从外周血中分离得到单个核细胞，用含l〇v/V%FBS 的RPMI 1640培养基和IFN- y在培养瓶中培养，通过添加IL-2促进CIK细胞在体外大量扩 增，再分装到多个培养瓶中或者转入培养袋中扩增培养。现有CIK细胞的培养规模小，操作 复杂，步骤繁琐，扩增倍数低，所扩增得到的数量不够用于临床治疗，而且培养密度不能过 高，浪费培养基，不利于节约成本和培养空间。此外表面抗原表达量低，杀伤效果差。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培 养CIK细胞的方法。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] -种使用生物反应器培养CIK细胞的方法，搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料。 [0011]优选地，所述使用生物反应器培养CIK细胞的方法，包括以下步骤：
[0012]用X-VIV0 15培养基将PBMC按照1 X 106cells/ml的密度接种于培养瓶中，添加 1% 培养基体积的IFN- y溶液，在37°C、5 %C02条件下培养，第二天各添加 1 %培养基体积的IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液继续培养，当培养体系达到一定体积后，转入生物反应器 中继续培养至两周，每2~3天补充适量的培养基和IL-2;
[0013] 所述IFN- y溶液的浓度为100~1000U/ml，IL-la溶液的浓度为500~2000U/ml， IL-2溶液的浓度为100~1000U/ml，0KT-3溶液的浓度为500~2000U/ml。
[0014] 优选地，所述IFN- y溶液的浓度为300U/ml，IL-la溶液的浓度为500U/ml，IL-2溶 液的浓度为200U/ml，0KT-3溶液的浓度为500U/ml。
[0015]优选地，在生物反应器中培养CIK细胞的条件为：溶氧量为50%，pH7.2，搅拌速度 为45rpm〇
[0016]优选地，当培养体系大于500ml时，转入2L生物反应器中继续培养。
[0017] 优选地，所述PBMC通过以下方法获得：
[0018]外周血和生理盐水按体积比1:1进行稀释得到血液稀释液，将其加至二分之一倍 体积的淋巴细胞分离液上方，升降速调为0,800g离心30min，取单个核细胞层，用RPMI1640 培养基清洗两次，用X-VIV0-15培养基重悬细胞即得PBMC。
[0019] -种生物反应器搅拌桨，所述搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。
[0020] -种生物反应器，所述生物反应器的搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。
[0021] 优选地，所述减小剪切力的材料为医用硅胶管或食用橡胶管。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0023] 1、本发明使用生物反应器培养CIK细胞，在搅拌桨外包裹可以减小剪切力的材料， 可以降低细胞受到的剪切力伤害，有利于细胞大量扩增。
[0024] 2、本发明使用生物反应器培养CIK细胞，在培养过程中不停的搅拌，为动态系统， 有利于细胞进行气体交换和为细胞提供均一的培养环境，有利于细胞大量扩增。
[0025] 3、本发明使用生物反应器培养CIK细胞，在保证细胞质量的前提下，能够显著提高 细胞培养密度，有利于节约培养基和培养空间。
[0026] 4、本发明使用生物反应器培养CIK细胞，更接近人体内三维生长环境，与使用培养 瓶、培养袋等细胞贴壁生长的培养方式相比，更利于细胞大量扩增，可以大规模培养CIK细 胞，而且所得CIK细胞表面抗原表达量较高，对肿瘤细胞的杀伤活性较强。
【附图说明】
[0027] 图1为实施例1培养的CIK细胞的流式检测结果。
[0028] 图2为对比例1培养的CIK细胞的流式检测结果。
[0029] 图3为对比例2培养的CIK细胞的流式检测结果。
[0030] 图4为CIK细胞对K562细胞的杀伤活性结果。
【具体实施方式】
[0031]为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所 用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。 [0032] CIK细胞是PBMC在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细 胞，其主要效应细胞是⑶3+⑶56+细胞。PBMC可以使用现有任何方法获得，本发明中PBMC通过 以下方法制备：
[0033] 把60ml外周血转移至离心管中，用生理盐水按体积比1:1进行稀释，得到血液稀释 液;在一新离心管中加入淋巴细胞分离液，把血液稀释液缓慢添加至淋巴细胞液层上方，形 成明显的分界线，其中，淋巴细胞分离液与血液稀释液的体积比为1:2;升降速调为0,800g 离心30min，离心结束后，用巴氏吸管小心抽取单个核细胞层至另一新离心管中，往该离心 管中添加RPMI1640培养基清洗细胞，300g离心5min，弃上清，再次添加RPMI1640培养基清洗 细胞，300g离心5min，弃上清；用X-VIVO-15培养基重悬细胞得到PBMC悬液。取20yl PBMC悬 液用台盼蓝染色法(台盼蓝与PBMC悬液体积比为1:1)进行计数。
[0034] 实施例1
[0035]自2L生物反应器(购自北京元唐盛兴科技有限公司，美国BELLC0)中取出搅拌桨， 在搅拌桨外套上医用硅胶管，紫外照射灭菌后，重新将搅拌桨装回生物反应器内。使用该生 物反应器培养CIK的方法如下：
[0036] 取2 X 107个PBMC，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培养基接种于T75培养 瓶中，并添加1 %培养基体积的IFN- y溶液，在37°C、5%C02条件下培养，第二天添加IL-la 溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液继续培养，IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液的添加量为 培养基体积的1%。根据细胞的扩增情况，进行分瓶培养，当培养体系总量大于500ml时，将 其转入2L生物反应器中，按照温度37 °C，C02通气量为5 %，溶氧量为50 %，pH为7.2，搅拌速 度为45rpm的条件继续培养至两周，培养基为含1~10U/ml IL-2的X-VIV0 15培养基。
[0037] 所述IFN- y溶液的浓度为100~1000U/ml，IL-la溶液的浓度为500~2000U/ml， IL-2溶液的浓度为100~1000U/ml，0KT-3溶液的浓度为500~2000U/ml。本实施例中IFN-y 溶液的浓度为300U/ml，IL-la溶液的浓度为500U/ml，IL-2溶液的浓度为200U/ml，0KT-3溶 液的浓度为500U/ml。
[0038] 整个培养过程中观察并记录细胞生长情况，每2~3天进行细胞计数并补充适量的 培养基和IL-2,培养体系中IL-2的浓度为1~10U/ml。
[0039] 对比例1
[0040] 取2 X 107个PBMC，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培养基接种于T75培养 瓶中，并添加1 %培养基体积的IFN- y溶液，在37°C、5%C02条件下培养，第二天添加IL-la 溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液继续培养，IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液的添加量为 培养基体积的1%。根据细胞的扩增情况，进行分瓶培养，当培养体系总量大于500ml时，将 其转入2L培养袋中继续培养至两周，培养条件与实施例1相同。
[0041] 所述IFN-y溶液的浓度为100~1000U/ml，IL-la溶液的浓度为500~2000U/ml， IL-2溶液的浓度为100~1000U/ml，0KT-3溶液的浓度为500~2000U/ml。本实施例中IFN-y 溶液的浓度为300U/ml，IL-la溶液的浓度为500U/ml，IL-2溶液的浓度为200U/ml，0KT-3溶 液的浓度为500U/ml。
[0042] 整个培养过程中观察并记录细胞生长情况，每2~3天进行细胞计数并补充适量的 培养基和IL-2,使细胞密度为1 X 106cells/ml，培养体系中IL-2的浓度为1~10U/ml。
[0043] 对比例2
[0044] 取2 X 107个PBMC，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培养基接种于T75培养 瓶中，并添加1 %培养基体积的IFN- y溶液，在37°C、5%C02条件下培养，第二天添加IL-la 溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液继续培养，IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液的添加量为 培养基体积的1%。根据细胞的扩增情况，进行分瓶培养，当培养体系总量大于200ml时，则 进行分瓶培养，每瓶培养体积不超过200ml，培养至两周。
[0045] 所述IFN- y溶液的浓度为100~1000U/ml，IL-la溶液的浓度为500~2000U/ml， IL-2溶液的浓度为100~1000U/ml，0KT-3溶液的浓度为500~2000U/ml。本实施例中IFN-y 溶液的浓度为300U/ml，IL-la溶液的浓度为500U/ml，IL-2溶液的浓度为200U/ml，0KT-3溶 液的浓度为500U/ml。
[0046] 整个培养过程中观察并记录细胞生长情况，每2~3天进行细胞计数并补充适量的 培养基和IL-2,使细胞密度为1 X 106cells/ml，培养体系中IL-2的浓度为1~10U/ml。
[0047]效果实施例1
[0048]在各实施例、对比例培养结束后收集CIK细胞，采用台盼蓝染色法进行细胞计数， 计算细胞的扩增倍数，结果如表1所示。
[0049]表1、CIK细胞扩增倍数、活力、培养体积以及细胞密度表
[00511由表1可知，使用实施例1方法培养CIK细胞，扩增倍数高达503倍，是对比例1扩增 倍数的近2倍，是对比例2扩增倍数的近5倍。所以，使用本发明方法培养CIK细胞可以大大提 高CIK细胞的扩增倍数，细胞密度大，而且保持较高的细胞活力。
[0052]效果实施例2
[0053] 在各实施例、对比例培养结束后收集CIK细胞，采用常规方法进行流式检测，考察 CIK细胞的表面抗原⑶3、⑶56的表达情况，结果如表2和图1-3所示。
[0054] 表2、⑶3+⑶56+表达量表
[0056]由表2和图1-3可知，使用实施例1方法培养得到的CIK细胞，其⑶3+⑶56+表达量为 27.2%，而使用对比例1方法培养得到的CIK细胞的⑶3+⑶56+表达量为24.8%，用对比例2方 法培养得到的CIK细胞的CD3+CD56+表达量为11.5% .所以，本发明方法培养得到的CIK细胞 的表面抗原表达量较高。
[0057]效果实施例3
[0058]在各实施例、对比例培养结束后收集CIK细胞，采用乳酸脱氢酶释放法进行其对 K562细胞的杀伤活性检测，结果如表3和图4所示。
[0059] 表3、CIK细胞杀伤活性表
[0061 ]由表3和图4可知，效靶比为40 :1时，实施例1中CIK细胞对K562细胞的杀伤活性为 58%，对比例1和对比例2中CIK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为46%、39%;效靶比为20: 1时，实施例1中CIK细胞对K562细胞的杀伤活性为42%，对比例1和对比例2中CIK细胞对 K562细胞的杀伤活性分别为31 %、22% ;效靶比为10:1时，实施例1中CIK细胞对K562细胞的 杀伤活性为17%，对比例1和对比例2中CIK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为12%、10%。 因此，本发明方法培养得到的CIK细胞对K562细胞的杀伤活性较高。
[0062]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种使用生物反应器培养CIK细胞的方法，其特征在于，搅拌桨外包裹有减小剪切力 的材料。2. 根据权利要求1所述的使用生物反应器培养CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下 步骤： 用X-VIVO 15培养基将PBMC按照1 X 106cells/ml的密度接种于培养瓶中，添加1%培养 基体积的IFN- γ溶液，在37°C、5%C02条件下培养，第二天各添加1 %培养基体积的IL-la溶 液、IL-2溶液以及0KT-3溶液继续培养，当培养体系达到一定体积后，转入生物反应器中继 续培养至两周，每2~3天补充适量的培养基和IL-2; 所述IFN- γ溶液的浓度为100~1000U/ml，IL-la溶液的浓度为500~2000U/ml，IL-2溶 液的浓度为100~l〇〇〇U/ml，0KT-3溶液的浓度为500~2000U/ml。3. 根据权利要求1所述的使用生物反应器培养CIK细胞的方法，其特征在于，所述减小 剪切力的材料为医用硅胶管或食用橡胶管。4. 根据权利要求2所述的使用生物反应器培养CIK细胞的方法，其特征在于，所述IFN-γ溶液的浓度为300U/ml，IL-la溶液的浓度为500U/ml，IL-2溶液的浓度为200U/ml，0KT-3 溶液的浓度为500U/ml。5. 根据权利要求2所述的使用生物反应器培养CIK细胞的方法，其特征在于，当培养体 系大于500ml时，转入2L生物反应器中继续培养。6. 根据权利要求2所述的使用生物反应器培养CIK细胞的方法，其特征在于，在生物反 应器中培养CIK细胞的条件为:溶氧量为50%，pH7.2，搅拌速度为45rpm。7. -种生物反应器搅拌桨，其特征在于，所述搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。8. 根据权利要求7所述的生物反应器搅拌桨，其特征在于，所述减小剪切力的材料为医 用硅胶管或食用橡胶管。9. 一种生物反应器，其特征在于，所述生物反应器的搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。10. 根据权利要求9所述的使用生物反应器，其特征在于，所述减小剪切力的材料为医 用硅胶管或食用橡胶管。
【文档编号】C12N5/0783GK105821000SQ201610141283
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月11日
【发明人】王飞, 王一飞, 陈海佳, 葛啸虎, 曾维杰
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司