缓释组分培养免疫细胞方法
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明涉及一种缓释组分培养免疫细胞方法。
[0002]【背景技术】:
经典的CIK细胞培养方法需要通过多种细胞因子的共同培养诱导，如白细胞介素2、干扰素、抗CD3单克隆抗体等，传统方法是将这些细胞因子直接加入细胞培养基中，但是细胞因子在培养基中浓度减少较快，需要每天添加细胞因子，工作效率低，且影响细胞增殖速率。
[0003]
【发明内容】
:
本发明的目的是提供一种缓释组分培养免疫细胞方法。
[0004]上述的目的通过以下的技术方案实现:
一种缓释组分培养免疫细胞方法，将采集分离得到的外周血单个核细胞与含15%胎牛血清的DMEM—起置于包被有重组人纤维连接片断的培养瓶中，培养至第2日，加入各细胞因子微球100(^8/1111、抗0)3单克隆抗体2 4 8/1111、白细胞介素2 1000 yg/ml;放入37°C、5% 0)2培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为0.5X 10 6-l.5XlOVmlο之后每3天更换培养基，每7天添加细胞因子微球至培养至第14天，细胞成熟。
[0005]培养时大约每_升培养基中含7 μ I PLGA微球制备液(每微升制备液中含有1000个微球)。PLGA微球10-50 μ m，包含0.5%细胞因子(活性剂)，3% Mg(OH) 2 (PH稳定剂)，肝素(生长因子稳定剂):细胞因子重量比=1:1，I mM EDTA。
[0006]有益效果:
1.本发明应用乳化溶剂蒸发法制作PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)微球，含有PLGA及PVA (聚乙烯醇)，PVA为稳定剂或乳化剂。根据微球大小不同PVA含量不同，释放曲线不同。PLGA微球尺寸10-40 μ m，平均直径为20 μ m，尺寸可由搅拌速度不同控制。
[0007]本发明将细胞因子(白细胞介素2、干扰素、抗CD3单克隆抗体)加入微囊或微球中，应用其缓释特性使生长因子在培养基中能够持续平稳、释放，节省成本、提高工作效率、使免疫细胞平稳扩增。
[0008]本发明缓释组分可使用多种，如:微球(PLGA微球)、无水聚乙烯醇(PVA)、纳米泵、藻酸盐凝胶、生物可降解水凝胶、脂质体、络合剂、持续释放微泵、纳米微粒、其它生物相容性材料。
[0009]【附图说明】:
附图1是本发明为在培养基中添加含细胞因子的常规培养基后，IL-2浓度在培养基中随时间的变化百分比。
[0010]附图2是本发明比较在培养基中直接加入IL-2细胞因子及加入IL-2微球后，IL-2浓度在培养基中随时间变化的百分比。
[0011]附图3是本发明比较在培养基中直接加入细胞因子及加入IL-2、IFN-γ、⑶3McAb微球后，CIK细胞集落形成情况。
[0012]【具体实施方式】: 实施例1:
一种缓释组分培养免疫细胞方法，将采集分离得到的外周血单个核细胞与含15%胎牛血清的DMEM—起置于包被有重组人纤维连接片断的培养瓶中，培养至第2日，加入各细胞因子微球100(^8/1111、抗0)3单克隆抗体2 4 8/1111、白细胞介素2 1000 yg/ml;放入37°C、5% C02培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为0.5 X 16-L 5 XlOfVml。之后每3天更换培养基，每7天添加细胞因子微球至培养至第14天，细胞成熟。
[0013]实施例2:
本发明应用乳化溶剂蒸发法制作PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)微球，含有PLGA及PVA (聚乙烯醇)，PVA为稳定剂或乳化剂。
[0014]根据微球大小不同PVA含量不同，释放曲线不同。PLGA微球尺寸10-40 μπι,平均直径为20 μm，尺寸可由搅拌速度不同控制。培养时大约每_升培养基中含7 μ I PLGA微球制备液(每微升制备液中含有1000个微球)。PLGA微球10-50 μ m，包含0.5%细胞因子(活性剂)，3% Mg (OH) 2 (PH稳定剂)，肝素(生长因子稳定剂):细胞因子重量比=1:1，
I mM EDTA。
【主权项】
1.一种缓释组分培养免疫细胞方法，其特征是:将采集分离得到的外周血单个核细胞与含15%胎牛血清的DMEM—起置于包被有重组人纤维连接片断的培养瓶中，培养至第2日，加入各细胞因子微球1000 μ g/ml、抗⑶3单克隆抗体2 μ g/ml、白细胞介素2 1000 μ g/ml ?’放入37°C、5%C02培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为0.5X 16-L 5X 16/ml，之后每3天更换培养基，每7天向培养基中添加细胞因子微球，培养至第14天，细胞成熟。
【专利摘要】缓释组分培养免疫细胞方法。传统方法是将这些细胞因子直接加入细胞培养基中，但是细胞因子在培养基中浓度减少较快，需要每天添加细胞因子，工作效率低，且影响细胞增殖速率。 本发明方法包括：将采集分离得到的外周血单个核细胞与含 15 ％胎牛血清的 DMEM 一起置于包被有重组人纤维连接片断的培养瓶中，培养至第 2 日，加入各细胞因子微球 1000μg/ml 、抗 CD3 单克隆抗体 2μg/ml 、白细胞介素 2 1000μg/ml ；放入 37 ℃、 5 ％ CO2 培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为 0.5×106-1.5×106/ml ；之后每 3 天更换培养基，每 7 天 向培养基中添加细胞因子微球，培养至第 14 天，细胞成熟。 本发明用于 培养免疫细胞 。
【IPC分类】C12N5-078
【公开号】CN104531616
【申请号】CN201410813001
【发明人】徐霜, 宋云庆, 栾志伟, 张阳
【申请人】哈尔滨壹加壹再生医学科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月24日