紧密连接免疫原多肽及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种紧密连接免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的紧密连接免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，采用化学合成所述的多肽；或者采用基因重组的方法，表达能够编码所述多肽的多核苷酸，得到所述多肽。本发明的紧密连接免疫原多肽用于卵巢癌肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，增强T细胞免疫应答。本发明的有益效果在于为全新的序列，可用于卵巢癌肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞，（2）促进CD8+免疫应答，（3）能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，（4）在荷瘤小鼠体内，能抑制卵巢癌肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR?T等细胞疗法。
【专利说明】
紧密连接免疫原多肽及其用途
技术领域
[0001] 本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的紧密连接免 疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
【背景技术】
[0002] 卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子 宫体癌而列居第三位。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位。卵巢恶性肿瘤中以 上皮癌最多见。目前，卵巢恶性肿瘤因病理类型不同而治疗方案不同，多用手术治疗联合化 疗等综合治疗。但对于中、晚期的患者，疗效欠佳。
[0003] 肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免 疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行 体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗 肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
[0004] Claudin蛋白是细胞间紧密连接的骨架蛋白。研究发现，claudin-4在原发性卵巢 癌中呈显著高表达，其升高的程度与卵巢癌组织分级和临床分期呈正相关。Claudin-4在卵 巢上皮性癌和黏液性囊腺癌等主要的卵巢癌中表达均上调，但在正常卵巢细胞和卵巢囊腺 瘤中无过表达，表明它的表达与恶性肿瘤相关，并且它的高表达与肿瘤恶性程度呈正相关。 claudin-4是恶性卵巢癌的标记物，可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，claudin-4由 209个氨基酸残基组成，分子量较大，较难得到纯度高的claudin-4。这样，不仅会给后期的 特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本发明提供了一种特异性 强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
【发明内容】
[0005] 发明目的
[0006] 本发明提供一种紧密连接免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞 免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
[0007] 技术方案
[0008] 本发明的技术方案在于提供一种紧密连接免疫原多肽，序列
[0009] NPLVASGQKRMMffffLLWAASGLLLLGGGLLCCNCPPRTDKPYSAKYSAA RSRGDSNYV(SEQ ID Ν0：1)〇
[0010] 有益效果
[0011] 本发明的紧密连接免疫原多肽，为全新的序列，可用于卵巢癌肿瘤免疫细胞技术 中的免疫原。有益效果在于（1)促进T细胞，（2)促进CD8+免疫应答，（3)能与T细胞表面的MHC 有效的特异性结合，（4)在荷瘤小鼠体内，能抑制卵巢癌肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标 分子，应用于CAR-T等细胞疗法。
【具体实施方式】
[0012]所述的多肽由上海生工吉尔合成。
[0013] 实施例1
[0014] 用肿瘤模型检测紧密连接免疫原多肽的体内活力。
[0015] 6-8龄雌性C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。⑴空白组；（2)多肽低剂量 组；（3)多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。建立卵巢癌肿瘤模型，在接种卵巢癌肿瘤细胞后 的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为:空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量： 5、10、20mg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示， 多肽可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率达到72.1 %。
[0016] 实施例2
[0017]应用竞争性受体-配体亲和法测试多肽与MH的结合能力：
[0018] 将多肽与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和法判断。将固定浓度为50μ mol/L的标记1251的多肽以及不同浓度（l-5〇 ym〇l/L)的多肽加入反应体系(磷酸盐缓冲液和 MHC，所述的MHC试剂盒购自上海泛柯生物科技有限公司，试剂盒内有HLA-A1、Α2、Α3、Al 1和 Α24)，在反应体系中形成两种复合物，即待测多肽MHC复合物和1251标记多肽复合物。待测多 肽与1251标记多肽竞争与MHC的结合。用超过滤(产品型号Microcon 30，Amicon公司）分离 游离多肽和多肽MHC复合物，然后测定多肽MHC复合物的1251放射量，将此放射量与没有竞 争性抑制的多肽MHC复合物（没有加待测多肽的样本）的放射量比较，求待测多肽在抑制 50%标记多肽与腿(：结合时的浓度，8卩1050。由此得到，多肽对!11^-六1^2、六3、六11和厶24的 IC50值分别为彡ΙΟμΜ，具体为3.49、4.32、1.56、7.42和3.29以111〇1/1，均符合阳性多肽的标 准。因此，多肽为具有有效结合能力的免疫原多肽。
[0019] 实施例3
[0020] Τ淋巴细胞的增殖作用:无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心（1000r/min，5min)，弃上清，TriS-NH4CL破解红细 胞，冰水浴静置3_5min，离心（1000r/min，5min)，弃上清，用无菌冷roS洗涤细胞两次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培养液（5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5*106 个/ml，于96孔培养板中培养。
[0021] 实验设空白对照组、模型组（刀豆蛋白A)、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分 别加入脾脏淋巴细胞悬液1〇〇μ1/孔后，空白对照组加入1640培养液100μ1，模型组加入ConA (终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加 ConA(终浓度为5yg/ ml)。37 °C细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20μ1 MTT，继续培养4h，最后弃掉 每孔所有溶液，每孔加入100ylDMS0，震荡，用酶标仪检测570nm处0D值，每孔设5个平行。 [0022]表1多肽对T淋巴细胞的增殖作用
[0024] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 与模型组相比。
[0025] 实验结果见表1，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为5 ~20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系，以20mg/ml的增殖率最高，为77.72%。
[0026] 实施例4
[0027] 紧密连接免疫原多肽的免疫原性测定:采用流式细胞技术测定免疫原多肽对CD8+ T细胞的影响。6-8龄雌性C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。（1)空白组；（2)免疫原 多肽低剂量组；（3)免疫原多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14天，分别进 行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量:5、10、20mg/Kg，在小 鼠背部淋巴结附近多点注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离心后取血细胞层， 用红细胞裂解液破解红细胞，洗去裂解的红细胞，再用荧光标记的单克隆抗CD8+-FITC(购 自北京华泰昕生物医疗技术有限公司）孵育、固定后，进行流式细胞技术测定，评价免疫原 多肽对CD8+T细胞的影响。
[0028] 表2多肽对⑶8+T淋巴细胞的作用
[0030] *P〈0 · 05，#P〈0 · 01 与模型组相比。
[0031]实验结果见表2,与空白组比较，多肽能促进小鼠 CD8+T淋巴细胞，在剂量为5~ 20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系，以20mg/Kg的增殖率最高，为66.82%。
【主权项】
1. 一种紧密连接免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列为SEQ ID NO: 1。2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于:治疗肿瘤药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于:在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫 应答药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK106046141SQ201610438412
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司