一种关于紧密连接免疫原多肽及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种关于紧密连接免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的紧密连接免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。本发明的紧密连接免疫原多肽用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，增强T细胞免疫应答。本发明的有益效果在于为全新的序列，可用于癌肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞，（2）促进CD8+免疫应答，（3）能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，（4）在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR?T等细胞疗法。
【专利说明】
一种关于紧密连接免疫原多肽及其用途
技术领域
[0001] 本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的紧密连接免 疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
【背景技术】
[0002] 肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免 疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行 体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗 肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
[0003] Claudin蛋白是细胞间紧密连接的骨架蛋白。研究发现，claudin-4在原发性卵巢 癌中呈显著高表达，其升高的程度与卵巢癌组织分级和临床分期呈正相关。Claudin-4在卵 巢上皮性癌和黏液性囊腺癌等主要的卵巢癌中表达均上调，但在正常卵巢细胞和卵巢囊腺 瘤中无过表达，表明它的表达与恶性肿瘤相关，并且它的高表达与肿瘤恶性程度呈正相关。 claudin-4是恶性卵巢癌的标记物，可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，claudin-4由 209个氨基酸残基组成，分子量较大，较难得到纯度高的claudin-4。这样，不仅会给后期的 特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本发明提供了一种特异性 强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
【发明内容】
[0004] 发明目的
[0005] 本发明提供一种紧密连接免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞 免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
[0006] 技术方案
[0007] 本发明的技术方案在于提供一种紧密连接免疫原多肽，序列为 VVFLLAGLLVIVPVSWTAHNIIQDFYNPLVASGSLYVGWAASGGGLLCCNCPP(SEQ ID NO：1)〇
[0008] 有益效果
[0009] 本发明的紧密连接免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免 疫原。有益效果在于（1)促进T细胞，（2)促进CD8+免疫应答，（3)能与T细胞表面的MHC有效的 特异性结合，（4)在荷瘤小鼠体内，能抑制卵巢癌肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应 用于CAR-T等细胞疗法。
【具体实施方式】
[0010]多肽由上海生工吉尔合成。
[0011] 实施例1
[0012] 用肿瘤模型检测紧密连接免疫原多肽的体内活力。
[0013] 6-8龄雌性C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。⑴空白组；（2)多肽低剂量 组；（3)多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。建立卵巢癌肿瘤模型，在接种卵巢癌肿瘤细胞后 的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为:空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量： 5、10、20mg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示， 多肽可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率达到74.1%。
[0014] 实施例2
[0015] 应用竞争性受体-配体亲和法测试多肽与MH的结合能力：
[0016] 将多肽与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和法判断。将固定浓度为50μ mol/L的标记1251的多肽以及不同浓度（l-5〇 ym〇l/L)的多肽加入反应体系(磷酸盐缓冲液和 MHC，所述的MHC试剂盒购自上海泛柯生物科技有限公司，试剂盒内有HLA-A1、Α2、Α3、Al 1和 Α24)，在反应体系中形成两种复合物，即待测多肽MHC复合物和1251标记多肽复合物。待测多 肽与 1251标记多肽竞争与MHC的结合。用超过滤(产品型号Microcon 30，Amicon公司）分离游 离多肽和多肽MHC复合物，然后测定多肽MHC复合物的1251放射量，将此放射量与没有竞争性 抑制的多肽MHC复合物(没有加待测多肽的样本)的放射量比较，求待测多肽在抑制50 %标 记多肽与MHC结合时的浓度，即IC50。由此得到，多肽对HLA-A1、A2、A3、A11和A24的IC50值分 别为彡ΙΟμΜ定为3.69、4.82、1.83、7.74和3.89以111〇1/1，均符合阳性多肽的标准。因此，多肽 为具有有效结合能力的免疫原多肽。
[0017] 实施例3
[0018] Τ淋巴细胞的增殖作用:无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心（1000r/min，5min)，弃上清，TriS-NH4CL破解红细 胞，冰水浴静置3_5min，离心（1000r/min，5min)，弃上清，用无菌冷roS洗涤细胞两次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培养液（5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5*106 个/ml，于96孔培养板中培养。
[0019] 实验设空白对照组、模型组（刀豆蛋白A)、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分 别加入脾脏淋巴细胞悬液1〇〇μ1/孔后，空白对照组加入1640培养液100μ1，模型组加入ConA (终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加 ConA(终浓度为5yg/ ml)。37 °C细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20μ1 MTT，继续培养4h，最后弃掉 每孔所有溶液，每孔加入100ylDMS0，震荡，用酶标仪检测570nm处0D值，每孔设5个平行。
[0020] 表1多妝对T淋R细朐的增葙作用
[0021]
[0022] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 与模型组相比。
[0023]实验结果见表1，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为5 ~20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。
[0024] 实施例4
[0025]紧密连接免疫原多肽的免疫原性测定:采用流式细胞技术测定免疫原多肽对CD8+ T细胞的影响。6-8龄雌性C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。（1)空白组；（2)免疫原 多肽低剂量组；（3)免疫原多肽中剂量组；（4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14天，分别进 行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量:5、10、20mg/Kg，在小 鼠背部淋巴结附近多点注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离心后取血细胞层， 用红细胞裂解液破解红细胞，洗去裂解的红细胞，再用荧光标记的单克隆抗CD8+-FITC(购 自北京华泰昕生物医疗技术有限公司）孵育、固定后，进行流式细胞技术测定，评价免疫原 多肽对CD8+T细胞的影响。
[0026] 表2多肽对⑶8+T淋巴细胞的作用
[0027]
[0028] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 与模型组相比。
[0029]实验结果见表2,与空白组比较，多肽能促进小鼠 CD8+T淋巴细胞，在剂量为5~ 20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。
【主权项】
1. 一种关于紧密连接免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列为SEQ ID N0:1。2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于:在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于:在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫 应答药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK106008676SQ201610438189
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月19日
【发明人】罗瑞雪
【申请人】苏州普罗达生物科技有限公司