短肽、其作为疫苗佐剂的应用及疫苗的制作方法
【专利摘要】短肽、其作为疫苗佐剂的应用及疫苗。本发明提供了一种短肽、所述短肽作为疫苗佐剂的应用以及以上述短肽作为疫苗佐剂的疫苗，该短肽制备简单、简便地与抗原物理混合后即可有效增强抗原免疫应答的能力。所述短肽序列为X?GFFYK，其中X为封端基团。优选的，所述短肽为D构型。上述短肽可以作为免疫佐剂来增强抗原的免疫原性，使得主体发生强烈的抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且所述短肽能适用于各类抗原；所述短肽易于制备、成份单一可控。
【专利说明】
短肽、其作为疫苗佐剂的应用及疫苗
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种短肽、其作为疫苗佐剂的应用及疫苗。
【背景技术】
[0002] 随着免疫学的不断深入研究、日益成熟的基因工程技术以及合成技术的飞速发 展，人类已研制出多种DNA重组疫苗、短肽疫苗等新型疫苗。这些新兴的疫苗虽然有很多优 点，例如易于合成、提纯、抗原特异性强，但其较弱的免疫原性却成为其致命的缺点，导致其 不能诱发强有力的免疫反应，限制了其在临床上的使用。在实际应用中，其往往需用免疫佐 剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的特异性应答。截止到目前为止，铝佐剂是唯一通 过FDA批准的能用于人的佐剂，然而它只能激发相应的体液免疫，不能诱导机体产生相应的 细胞免疫，而细胞免疫在很多疾病(病毒感染、肿瘤等)的免疫治疗方面又是必不可少的，因 此铝佐剂对许多病毒、疾病等抗原无免疫佐剂性效果，这就使得开发新型的能够用于人体 的治疗性免疫佐剂显得迫在眉睫。
[0003] 除了 Π )Α批准的应用于人体的铝佐剂，现在研究中或者可以应用于动物的佐剂主 要有弗氏佐剂、脂质体、单磷酰脂质A、细胞因子、CpG免疫调节序列等等。然而，这些免疫佐 剂不是安全性差，就是造价太高、不易于合成纯化，或者增强抗原免疫应答的能力差，尚不 能满足它们在临床使用的需求。
【发明内容】
[0004] 发明目的
[0005] 本发明的一个目的是提供一种短肽，其制备简单、简便地与抗原物理混合后即可 有效增强抗原免疫应答的能力。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述短肽作为疫苗佐剂的应用，该短肽制备简单、简 便地与抗原物理混合后即可有效增强抗原免疫应答的能力。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种以上述短肽作为疫苗佐剂的疫苗。
[0008] 发明概述
[0009] 发明人发现，包含序列FFY的一系列短肽简便地与抗原物理混合后即可有效增强 抗原免疫应答的能力，例如序列为X-GFFY、X-GFFYK的短肽，且D构型短肽的效果更优。
[0010] 根据本发明的第一方面，本发明提供了一种短肽，其序列为X-GFFYK，其中X为封端 基团。所述基团X可选择本领域常用的含芳香环封端基团，例如Nap。
[0011] "短肽"为本领域常用术语，指由3-9个氨基酸残基组成的短链肽。
[0012] 本发明中所述氨基酸序列如未特别说明，则对其构型无限制。
[0013]优选的，所述短肽为D构型，序列为X-GDFDFDY DK。
[0014]优选的，X为Nap，此时所述短肽的结构式如下：
[0015:
[0016] 所述短肽可米用公知的FM0C-固相合成方法合成。
[0017] 根据本发明的第二方面，还提供了所述短肽作为疫苗佐剂的应用。
[0018] 所述疫苗可以为多种疫苗，例如为蛋白疫苗或短肽疫苗。
[0019] 所述短肽作为疫苗佐剂应用时可选用多种物理形式，对其增强免疫应答的能力不 会产生实质性影响，例如可以与水混合均匀后与抗原混合得到疫苗，或者，由于所述短肽具 有良好的成胶性能，也可以以短肽水凝胶的形式进行应用，具体的，所述短肽的水混合物经 加热冷却的方法形成短肽水凝胶，然后与抗原混合，静置后形成的水凝胶用作疫苗。作为本 领域常识，所述短肽的水混合物应具备良好的生物相容性，因此，需要将短肽与具有良好生 物相容性的水溶液混合得到所述短肽的水混合物。常见的，所述具有良好生物相容性的水 溶液可以是生理盐水或PBS溶液。这种疫苗制备方法简单实用、成分可控。所述形成水凝胶 的加热冷却方法为公知方法，具体为:使用电吹风或者油浴锅等加热装置加热短肽的水混 合物至短肽完全溶解(一般需要加热到到90°C以上），冷却之后形成水凝胶(一般冷却至20-40°C即可）。成胶与否通过倒置瓶子的方法判断，保留在瓶子底部为水凝胶，如果是流动的 则为液体。
[0020] 在本发明的第三方面，还提供了一种以上述短肽作为疫苗佐剂的疫苗。所述短肽 可以方便地与抗原物理混合得到疫苗。优选所述短肽的水混合物经加热冷却的方法形成短 肽水凝胶，然后与抗原混合，静置后形成的水凝胶用作疫苗。所述疫苗可以为多种疫苗，例 如为蛋白疫苗或短肽疫苗。所述短肽的用量可以由本领域技术人员经简单实验确定，一般 用于蛋白疫苗和短肽疫苗时，所述短肽与抗原的质量比为5:1-30:1，更优选为5:1-20:1。
[0021] 发明人发现，上述短肽可以作为免疫佐剂来增强抗原的免疫原性，使得主体发生 强烈的抗原特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且所述短肽能适用于各类抗原;所述短肽 易于制备、成份单一可控。
[0022]本发明增加了免疫佐剂的种类，为开发能应用于人体的免疫佐剂提供了有价值的 信息。
【附图说明】
[0023]图1:蛋白疫苗vac-1、vac-2、0VA、Alum-0VA引发免疫反应的抗体滴度；
[0024]图2:蛋白疫苗vac-3、0VA、Alum-0VA引发免疫反应的抗体滴度；
[0025]图3:短肽疫苗￥8(3-4、6口；[1：(^6、41111]1-6口；[1：(^6引发免疫反应的抗体滴度 ；
[0026]图 4:细胞疫苗 ￥&(3-5、￥&(：-6、乂1'(：、1^161、〇161刺激0)8+正1丫+1'细胞增殖的效果 (图4a))以及它们的肿瘤抑制效果（图4b))。
【具体实施方式】
[0027] 下面用实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于本发明而不是限制本发 明。
[0028] 以下实施例中，通过本领域常用的倒置小瓶的方法检验水凝胶的形成与否。
[0029] 以下实施例中所涉及制剂来源如下：
[0030] 培养基，RMPI 1640,购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，无菌；
[0031 ] 胎牛血清，购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，无菌；
[0032] 2-cl-Trt树脂购自天津南开和成科技有限公司，活性1.2mmol/mL;
[0033] N，N-二异丙基乙胺（以下用DIEPA表示），购自西格马奥德里奇公司（Sigma-Aldrich)，纯度 99%;
[0034] 苯并三氮唑，，^^'-四甲基脲六氟磷酸酯丨以下用冊扣表示八购自吉尔生化 (上海)有限公司，纯度98%;
[0035] 三氟乙酸（以下用TFA表示），购自西格马奥德里奇公司（Sigma-Aldrich)，纯度 99% ；
[0036] 三异丙基硅烷（以下用TIS表示），购自西格马奥德里奇公司（Sigma-Aldrich)，纯 度 99 %;
[0037] L构型及D构型氨基酸购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98%;
[0038] 无内毒素的鸡卵清蛋白（以下简称0VA蛋白）购自InvivoGen公司，纯度99% ;
[0039] 铝佐剂购自赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，纯度99%;
[0040] 萘乙酸、氟代吩噻嗪、生物素购自西格马奥德里奇公司（Sigma-Aldrich，纯度 99% ；
[00411 短肽B+T epitope购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98%;
[0042]癌细胞EG7，购自上海歌凡生物，并按以下步骤培养：
[0043] 1)把水浴锅提前升温至37°C，将培养基、血清等放入水浴锅预热，并且同时打开超 净台紫外灯照射半小时；
[0044] 2)从液氮罐中取出冻存的癌细胞EG7，迅速放置在37 °C的水浴锅中使细胞解冻，之 后迅速转移到超净台里进行如下操作:把含细胞的溶液用移液器小心地转移到含有培养基 的离心管中，离心5分钟，去上清，用含有10%胎牛血清的培养基重悬，转移到含有10%胎牛 血清的培养基的培养皿中，然后放入37°C培养箱中培养；
[0045] 3)第二天观察细胞状态，待细胞状态良好后，传一代以后进行下面的实验；
[0046] 4)收集细胞培养液，吸入到离心管中，lOOOrpm转速下离心4min，之后弃掉溶液，加 入新鲜的培养基用枪吹打均匀，用细胞计数板计数为5 X 107个每毫升。
[0047] 所述0VA蛋白溶液为自制，将0VA蛋白溶于roS溶液(pH = 7.0)得到5mg/mL的0VA蛋 白溶液；
[0048] 所述5 X 107个每毫升的X光辐照后的癌细胞为自制:取1.5毫升5 X 107个每毫升的 癌细胞EG7，在辐照仪中以320伏电压、12.5安的电流辐照8.5分钟，辐照两次。
[0049] 其余试剂均为市售分析纯试剂。
[0050] 制备实施例1
[0051 ] pH 7.0和室温20°C下短肽水凝胶负载OVA蛋白的疫苗vac-ι的制备 [0052] (1)用FM0C-固相合成方法合成L构型短肽Nap-GFFY，结构式如下：
[0053]
[0054] 具体步骤如下：
[0055] 1)称取0.5mmol 2-cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的无水二氯甲烧（以下 用DCM表示），放置在摇床上摇晃5min，使2-cl-Trt树脂充分溶胀；
[0056] 2)用洗耳球把DCM从装有2-cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；
[0057] 3)将0 · 75mmol Fmoc保护的氨基酸溶解在10mL的无水DCM里，加入0 · 75mmol的 DIEPA，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.75mmol的DIEPA，在室温下反应lh;
[0058] 4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用无水DCM洗涤，每次DCM用量 1 OmL、洗涤lmin，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM: DIEPA:甲醇=17:1:2的溶液20mL， 在室温下反应lOmin;
[0059] 5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量1 OmL、洗 涤时间lmin，共洗5次，再用N，N-二甲基甲酰胺（以下用DMF表示)洗涤，每次DMF用量1 OmL、洗 涤时间lmin，共洗5次，加入10mL含体积百分比为20 %的哌啶的DMF，反应25min，再用10mL含 体积百分比为20 %的哌啶的DMF反应5min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间 lmin，共洗5次，结束后进行下一步反应；
[0060] 6)加入第二个Fmoc保护的氛基酸lmmol、HBTU 1 · 5mmol、DIEPA 2mmol和lOmlDMF， 把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h;
[0061] 7)重复步骤5)和6)的方法依次加入需要的氨基酸或封端基团；然后用DMF洗涤5 遍，二氯甲烷洗5遍，进行下步反应；
[0062] 8)按9 5 % TFA，2.5 % TIS，2.5 % H20体积百分比组成的溶液1 OmL加入到上述固相合 成器中，反应半小时(或者TFA与DCM的体积比为1:99，配制成体积百分比浓度为1 %的TFA溶 液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为lmin)，把产 物从2-cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯。
[0063]它的结构表征数据如下：
[0064] 4^^(40010^,01^0)38.29((1,1 = 7.3^,110,8.23(^ = 5.7^,111),8.17((1,1 = 7.9Hz,lH) ,8.02(d,J = 8.6Hz,lH) ,7.89-7.79(m,3H) ,7.75(s,lH),7.49-7.39(m,3H), 7.26-7.11(m,12H) ,7.08(d,J = 7.9Hz,2H),4.60-4.40(m,4H) ,3.71(dd,J=16.9,4.9Hz, 2H),3.57(dd,J=16.4,5.6Hz,3H),2.99-2.85(m,5H),2.81-2.74(m,lH),2.69-2.62(m, 1H).
[0065] (2)取lmg L构型短肽Nap-GFFY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升PBS溶液(pH =7.0 )，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.0，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之 后即得短肽水凝胶。
[0066] (3)取5mg/mL的0VA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝胶中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，进行物理混合，静置10分钟后成胶，得到蛋白疫苗vac-1(最终短肽 的浓度为2mg/mL，0VA蛋白浓度为0 · 2mg/mL)。
[0067]制备实施例2
[0068] pH 7.0和室温20°C下短肽水凝胶Nap-GDFDFDY负载0VA蛋白的疫苗vac-2的制备 [0069] (1)用FM0C-固相合成方法合成Nap-GDF DFDY，结构式如下：
[0070]
[0071] 具体步骤如下：
[0072] 1)称取0.5mmol 2-cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的DCM，放置在摇床上摇 晃5min，使2-cl-Trt树脂充分溶胀；
[0073] 2)用洗耳球把DCM从装有2-cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；
[0074] 3)将0 · 75mmol Fmoc保护的氨基酸溶解在10mL的无水DCM里，加入0 · 75mmol的 DIEPA，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.75mmol的DIEPA，在室温下反应lh;
[0075] 4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用无水DCM洗涤，每次DCM用量 10mL、洗涤lmin，共洗5次，每次1 OmL，加入配好的体积比为无水DCM: DΙΕΡΑ:甲醇=17:1:2的 溶液20mL，在室温下反应10min;
[0076] 5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量1 OmL、洗 涤时间lmin，共洗5次，再用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间lmin，共洗5次，加入10mL 含体积百分比为20 %的哌啶的DMF，反应25min，再用10mL含体积百分比为20 %的哌啶的DMF 反应5min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间lmin，共洗5次，结束后进行下一步 反应；
[0077] 6)加入第二个Fmoc保护的氛基酸lmmol、HBTU 1 · 5mmol、DIEPA 2mmol和lOmlDMF， 把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h;
[0078] 7)重复步骤5)和6)的方法依次加入需要的氨基酸或封端基团；然后用DMF洗涤5 遍，二氯甲烷洗5遍，进行下步反应；
[0079] 8)按9 5 % TFA，2.5 % TIS，2.5 % H20的体积比组成的溶液1 OmL加入到上述固相合成 器中，反应半小时（或者TFA与DCM的体积比为1:99，配制成体积百分比浓度为1 %的TFA溶 液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为lmin)，把产 物从2-cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯。
[0080] 它的结构表征数据如下：
[0081] 4^^(40010^,01^0)38.29((1,1 = 7.3^,110,8.23(^ = 5.7^,111),8.17((1,1 = 7.9Hz,lH) ,8.02(d,J = 8.6Hz,lH) ,7.89-7.79(m,3H) ,7.75(s,lH),7.49-7.39(m,3H), 7.26-7.11(m,12H) ,7.08(d,J = 7.9Hz,2H),4.60-4.40(m,4H) ,3.71(dd,J=16.9,4.9Hz, 2H),3.57(dd,J=16.4,5.6Hz,3H),2.99-2.85(m,5H),2.81-2.74(m,lH),2.69-2.62(m, 1H).
[0082] (2)取lmg Nap-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升roS溶液(pH=7.0)， 用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.0,加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到室温之后即得短 肽水凝胶。
[0083] (3)取5mg/mL的0VA蛋白溶液20微升加入到（2)中制得的水凝胶中，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，进行物理混合，静置8分钟后成胶，得到蛋白疫苗vac-2(最终短肽的 浓度为2mg/mL，0VA蛋白浓度为0.2mg/mL)。
[0084] 制备实施例3
[0085]用FM0C-固相合成方法合成短肽Nap-GDFDFDY DK，具体步骤如下：
[0086] 1)称取0.5mmol 2-cl-Trt树脂于固相合成器中，加入10mL的DCM，放置在摇床上摇 晃5min，使2-cl-Trt树脂充分溶胀；
[0087] 2)用洗耳球把DCM从装有2-cl-Trt树脂的固相合成器中压除干净；
[0088] 3)将0 · 75mmol Fmoc保护的氨基酸溶解在10mL的无水DCM里，加入0 · 75mmol的 DIEPA，然后转移到上述固相合成器中，再补加0.75mmol的DIEPA，在室温下反应lh;
[0089] 4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用无水DCM洗涤，每次DCM用量 10mL、洗涤时间lmin，共洗5次，加入配好的体积比为无水DCM: DIEPA:甲醇=17:1: 2的溶液 20mL，在室温下反应10min;
[0090] 5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用无水DCM洗涤，每次DCM用量1 OmL、洗 涤时间lmin，共洗5次，再用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间lmin，共洗5次，加入10mL 含体积百分比为20 %的哌啶的DMF，反应25min，再用10mL含体积百分比为20 %的哌啶的DMF 反应5min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL、洗涤时间lmin，共洗5次，结束后进行下一步 反应；
[0091] 6)加入第二个Fmoc保护的氛基酸lmmol、HBTU 1 · 5mmol、DIEPA 2mmol和lOmlDMF， 把配好的溶液加入到上述固相合成器中，反应2h;
[0092] 7)重复步骤5)和6)的方法依次加入需要的氨基酸或封端基团；然后用DMF洗涤5 遍，二氯甲烷洗5遍，进行下步反应；
[0093] 8)按9 5 % TFA，2.5 % TIS，2.5 % H20的体积比组成的溶液1 OmL加入到上述固相合成 器中，反应半小时（或者TFA与DCM的体积比为1:99，配制成体积百分比浓度为1 %的TFA溶 液，取该TFA溶液每次3mL加入到上述固相合成器中，共加十次，每次反应时间为lmin)，把产 物从2-cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯。
[0094]它的结构表征数据如下：
[0095] 4 MMR(400MHz，DMS0)S8.28((1, J = 6.3Hz，2H)，8.18((1, J = 8.3Hz，lH)，8.08(dd，J =8.0,4.0Hz,2H),7.89-7.72(m,7H),7.51-7.39(m,3H),7.24-7.05(m,13H),6.65(d,J= 8.4Hz,2H) ,4.49(dt,J = 21.4,10.8Hz,3H),3.72(dd,J=16.8,5.8Hz,lH) ,3.65-3.53(m, 3H),3.01-2.88(m,3H),2.70(m,6H),1.66-1.49(m,3H),1.41-1.28(m,3H).
[0096] 制备实施例4
[0097] pH 7.0和室温20°C下Nap_GDFDFDYDK短肽水凝胶负载OVA蛋白的疫苗vac-3的制备
[0098] (1)取lmg制备实施例1得到的Nap-GDFDF DYDK置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微 升PBS溶液(pH = 7.0)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.0，加热至沸腾使化合物完全溶解， 冷却到室温之后即得短肽水凝胶。
[0099] (2)取5mg/mL的0VA蛋白溶液20微升加入到（1)制得的水凝胶中，用roS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，进行物理混合，静置16分钟后成胶，得到蛋白疫苗vac-3(最终短肽的 浓度为2mg/mL，0VA蛋白浓度为0.2mg/mL)。
[0100] 制备实施例5
[0101] pH 7.0和室温20°C下Nap_GDFDFDYDK短肽水凝胶负载B+T epitope短肽的疫苗vac-4的制备
[0102] (1)取lmg制备实施例1制备的Nap-GDFDF DYDK置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微 升PBS溶液(pH = 7.0)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.0，加热至沸腾使化合物完全溶解， 冷却到室温之后即得短肽水凝胶。
[0103] (2)取25微升20mg/mL B+T epitope短肽(500微克）的加入到（1)制得的水凝胶中， 进行物理混合，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，静置14分钟后成胶，得到短肽疫苗 vac-4(最终短肽的浓度为2mg/mL，B+T epitope短肽的浓度为lmg/mL)。
[0104] B+T epitope短肽结构式如下所示：
[0105]
[0106] 制备实施例6
[0107] pH 7.0和室温20°C下L构型Nap-GFFY短肽水凝胶负载辐照后的癌细胞的疫苗vac-5的制备
[0108] (1)取lmg制备实施例1中制备的L构型Nap-GFFY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400 微升PBS溶液(pH= 7.0)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.0，加热至沸腾使化合物完全溶 解，冷却到室温之后即得短肽水凝胶。
[0109] (2)取100微升5X107个每毫升的X光辐照后的癌细胞加入到（1)中制得的水凝胶 中，进行物理混合，静置13分钟后成胶，得到细胞疫苗vac-5(最终短肽的浓度为2mg/mL，辐 照后的癌细胞的浓度为1 X 1〇7个每毫升）。
[0110] 制备实施例7
[0111] pH 7.0和室温20°C下Nap-GDFDFDY短肽水凝胶负载辐照后的癌细胞的疫苗vac-6的 制备
[0112] (1)取lmg制备实施例2中制备的Nap-GDFDF DY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微 升PBS溶液(pH = 7.0)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.0，加热至沸腾使化合物完全溶解， 冷却到室温之后即得短肽水凝胶。
[0113] (2)取100微升5X107个每毫升的X光辐照后的癌细胞加入到（1)中制得的水凝胶 中，进行物理混合，静置10分钟后成胶，得到细胞疫苗vac-6(最终短肽的浓度为2mg/mL，辐 照后的癌细胞的浓度为1 X 1〇7个每毫升）。
[0114] 对比制备例1
[0115] 取5mg/mL的0VA蛋白溶液20微升，用roS溶液(pH = 7.0)定容至500微升，得到不含 佐剂的蛋白疫苗0VA(最终0VA蛋白浓度为0.2mg/mL)。
[0116] 对比制备例2
[0117] (1)取40mg/mL的铝佐剂62 · 5微升，用PBS溶液(pH= 7 · 0)定容至250微升，得到铝佐 剂分散液。
[0118] (2)取5mg/mL的0VA蛋白溶液20微升加入到（1)中制得的铝佐剂分散液，用PBS溶液 (pH= 7.0)定容于500微升，进行物理混合，得到的混合物为含铝佐剂的蛋白疫苗Alum-OVA。 (最终铝佐剂的浓度为5mg/mL，OVA蛋白浓度为0.2mg/mL)
[0119] 对比制备例3
[0120] 取100微升5X107个每毫升的X光辐照后的癌细胞，用PBS溶液(pH=7.0)定容至 500微升，得到不含佐剂的细胞疫苗XTC(最终辐照后的癌细胞的浓度为1 X 107个每毫升）。
[0121] 对比制备例4
[0122] pH 7.0和室温20°C下短肽水凝胶L-gel的制备
[0123] 取lmg制备实施例1制备的L构型短肽Nap-GFFY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400 微升PBS溶液(pH= 7.0)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.0，加热至沸腾使化合物完全溶 解，冷却到室温之后形成水凝胶，用PBS溶液(pH=7.0)定容于500微升，静置10分钟后成胶， 即为水凝胶L-gel (最终短肽的浓度为2mg/mL)。
[0124] 对比制备例5
[0125] pH 7.0和室温20°C下短肽水凝胶D-gel的制备
[0126] 取lmg制备实施例2制备的Nap-GDFDFDY置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入400微升roS 溶液(pH=7.0)，用碳酸钠溶液将其pH值调节至7.0，加热至沸腾使化合物完全溶解，冷却到 室温之后形成水凝胶，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，静置8分钟后成胶，即为水凝胶 D-gel (最终短肽的浓度为2mg/mL)。
[0127] 对比制备例6
[0128] 取25微升20mg/mL B+T epitope短肽（500微克），用PBS溶液（ρΗ = 7·0)定容至500 微升，得到不含佐剂的短肽疫苗epitope(最终B+T epitope短肽的浓度为lmg/mL)。
[0129] 对比制备例7
[0130] (1)取40mg/mL的铝佐剂62 · 5微升，用PBS溶液(pH= 7 · 0)定容至250微升，得到铝佐 剂分散液。
[0131] (2)取25微升20mg/mL短肽B+T epitope(500微克)加入到（1)中制得的铝佐剂分散 液，用PBS溶液(pH = 7.0)定容于500微升，进行物理混合，得到的混合物为含铝佐剂的短肽 疫苗Alum-epitope。
[0132] 免疫实施例1
[0133] (1)小鼠第一次免疫
[0134] 取6-8周的小鼠，以第一次注射时间记为0天，取制备实施例1、制备实施例2、对比 制备例1、对比制备例2中制得的蛋白疫苗以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只 老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
[0135] (2)小鼠第二次免疫
[0136] 在第14天的时间点，取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例2中 制得的蛋白疫苗以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠1〇〇微升的剂量在小 鼠腹股沟处进行皮下注射。
[0137] (3)抗体滴度的测量
[0138] 在第21天的时候取小鼠血清，使用BioTek酶标仪，用Elisa的方法进行相应抗体滴 度的测量。结果如图1所示。
[0139] 从图1中的结果看出：其中I gG代表总的抗体滴度;I gG 1是其中一个表型，表示体液 免疫应答；IgG2a和IgG2b也是其中一个表型，表示细胞免疫水平。与不含佐剂的0VA蛋白组 (对比制备例1)对比，使用L构型多肽水凝胶和0VA蛋白的组(制备实施例1)可提高IgG抗体 滴度60倍，使用D构型多肽水凝胶和0VA蛋白的组(制备实施例2)可提高580倍，而使用铝佐 剂和0VA蛋白的组(对比制备例2)仅可提高165倍;与不含佐剂的0VA蛋白组(对比制备例1) 对比，使用L构型多肽水凝胶和0VA蛋白的组(制备实施例1)可提高IgGl抗体滴度167倍，使 用D构型多肽水凝胶和0VA蛋制备2)仅可提高135倍;与不含佐剂的0VA蛋白组(对比制备例 1) 对比，使用L构型多肽水凝胶和0VA蛋白的组(制备实施例1)可提高IgG2a抗体滴度10倍， 使用D构型多肽水凝胶和0VA蛋白的组(制备实施例2)可提高60倍，而使用铝佐剂和0VA蛋白 的组(对比制备例2)仅可提高12倍;与不含佐剂的0VA蛋白组(对比制备例1)对比，使用L构 型多肽水凝胶和0VA蛋白的组(制备实施例1)可提高I gG2b抗体滴度30倍，使用D构型多肽水 凝胶和0VA蛋白的组(制备实施例2)可提高90倍，而使用铝佐剂和0VA蛋白的组(对比制备例 2) 仅可提高60倍。
[0140] 免疫实施例2
[0141] (1)小鼠第一次免疫
[0142] 取6-8周的小鼠，以第一次注射时间记为0天，取制备实施例4、对比制备例1、对比 制备例2中制得的蛋白疫苗以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠100微升 的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
[0143] (2)小鼠第二次免疫
[0144] 在第14天的时间点，取制备实施例4、对比制备例1、对比制备例2中制得的蛋白疫 苗以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠1〇〇微升的剂量在小鼠腹股沟处进 行皮下注射。
[0145] (3)抗体滴度的测量
[0146] 在第21天的时候取小鼠血清，使用BioTek酶标仪，用Elisa的方法进行相应抗体滴 度的测量。结果如图2所示。
[0147] 从图2中的结果看出：与不含佐剂的0VA蛋白组(对比制备例1)对比，使用D构型短 肽水凝胶和0VA蛋白的组(制备实施例4)可提高IgG抗体滴度233倍，而使用铝佐剂和0VA蛋 白的组(对比制备例2)仅可提高64倍。
[0148] 免疫实施例3
[0149] (1)小鼠第一次免疫
[0150] 取6-8周的小鼠，以第一次注射时间记为0天，取制备实施例5、对比制备例6、对比 制备例7中制得的短肽疫苗以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠100微升 的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
[0151] (2)小鼠第二次免疫
[0152]在第14天的时间点，取制备实施例5、对比制备例6、对比制备例7中制得的短肽疫 苗以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠1〇〇微升的剂量在小鼠腹股沟处进 行皮下注射。
[0153] (3)抗体滴度的测量
[0154] 在第21天的时候取小鼠血清，使用BioTek酶标仪，用Elisa的方法进行相应抗体滴 度的测量。结果如图3所示。
[0155] 从图3中的结果看出：与不含佐剂的短肽疫苗组(对比制备例6)对比，以D构型多肽 水凝胶Nap-GDF DFDYDK负载短肽B+T epitope组（制备实施例5)可提高IgG抗体滴度26倍，而 含铝佐剂的短肽疫苗组(对比制备例7)没有提高。
[0156] 免疫实施例4
[0157] (1)小鼠第一次免疫
[0158]取6-8周的小鼠，以第一次注射时间记为0天，取无内毒素、无菌的PBS溶液以及制 备实施例6-7、对比制备例3-5中制得的细胞疫苗以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别 以每只老鼠1 〇〇微升的剂量在小鼠背部进行皮下注射。
[0159] (2)小鼠第二次免疫
[0160] 在第14天的时间点，取无内毒素、无菌的PBS溶液以及制备实施例6-7、对比制备例 3-5中制得的细胞疫苗以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠100微升的剂 量在小鼠背部进行皮下注射。
[0161] (3)小鼠第三次免疫
[0162] 在第21天的时间点，取无内毒素、无菌的PBS溶液以及制备实施例6-7、对比制备例 3-5中制得的细胞疫苗以涡旋仪将水凝胶打散成粘稠溶液后分别以每只老鼠100微升的剂 量在小鼠背部进行皮下注射。
[0163] (4)小鼠刺激CD8+IFN- γ +T细胞增殖的测试
[0164] 在第28天取小鼠脾细胞，通过使用BD FACS Calibur流式细胞仪进行流式检测。结 果如图4a)所示。
[0165] (5)小鼠肿瘤抑制实验
[0166] 在第28天用未辐照的癌细胞接种小鼠背部，接种量IX 106个癌细胞，随着肿瘤生 长，在小鼠背部出现肉眼可见的肿瘤，定期测试肿瘤大小，以此评价肿瘤抑制效果。测试方 法如下：用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长(最长径）和宽（垂直于最长径方向的宽度），肿瘤体 积按照公式【长X宽X(长+宽)/2】计算。结果如图4b)所示。
[0167] 细胞免疫应答对于肿瘤的治疗相当关键。实验结果显示，被Nap_GDFDFDY水凝胶负 载辐照后癌细胞(vac-6)免疫的小鼠相比于其他实验组展示出了更强的CD8+IFN-y+增强 效果(如图4a))，这表明它能提高细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的表达，CTL有利于肿瘤抑制。如 图4b)，在PBS组和水凝胶组D-gel、L-gel，肿瘤生长曲线没有明显差别，但是在接种细胞疫 苗XTC(图中实心正方形表示）、vac-5(图中实心菱形表示）、vac-6(图中空心三角形表示）的 实验组肿瘤生长得到抑制并且延长了小鼠的生存周期。其中D构型水凝胶负载辐照后的癌 细胞(vac-6)的免疫效果最为明显。这些结果与之前的蛋白疫苗的实验结果一致。
【主权项】
1. 一种短肽，其序列为X-GFFYK，其中X为封端基团。2. 如权利要求1所述的短肽，其特征在于，所述短肽为D构型，序列为X-GdFdFdY dK。3. 如权利要求1或2所述的短肽，其特征在于，X为Nap。4. 权利要求1-3中任一项所述短肽作为疫苗佐剂的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述短肽的水混合物经加热冷却的方法形成 短肽水凝胶，然后与抗原混合，静置后形成的水凝胶用作疫苗。6. 如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述疫苗为蛋白疫苗或短肽疫苗。7. 以权利要求1-3中任一项所述短肽作为疫苗佐剂的疫苗。8. 如权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述短肽与抗原物理混合得到疫苗，优选所 述短肽的水混合物经加热冷却的方法形成短肽水凝胶，然后与抗原混合，静置后形成的水 凝胶用作疫苗。9. 如权利要求7或8所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为蛋白疫苗或短肽疫苗。
【文档编号】A61K39/39GK106008667SQ201610396553
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】杨志谋, 王玲, 杨成彪, 王怀民
【申请人】南开大学