用于卵内禽类接种的佐剂疫苗的制作方法
【专利说明】用于卵内禽类接种的佐剂疫苗
[0001] 本发明涉及佐剂在配制疫苗组合物中的用途，该疫苗组合物预期用于预防禽类疾 病，且预期通过卵内施用（注入卵内）应用，该佐剂包含至少一种油相和至少一种可药用二 价无机盐。
[0002] 疫苗佐剂是放大针对与之组合的疫苗抗原的免疫学反应的赋形剂。这些佐剂性质 多样。它们可以同等地由脂质体、含有至少一种油相和至少一种水相的乳剂（如"弗氏"佐 剂）、生物来源的佐剂(细胞因子、寡核苷酸等)或水不溶性无机盐组成。在用作疫苗组合物 佐剂的无机盐中，可以提到例如非常常用的氢氧化铝。对于含有灭活抗原且预期用于注射 禽类物种的疫苗组合物的配制，主要使用油包水乳剂类型的佐剂。
[0003] 在疫苗组合物中使用佐剂尤其使得可能：
[0004] -提高一剂疫苗所赋予的保护性反应的强度，使得可能提供更好的保护水平；
[0005] -延长一剂疫苗所赋予的保护的持续时间，提供农场动物(animals on farms)在 其整个生长期内，持续时间更长的保护；
[0006] -以较低抗原剂量获得等同于在无佐剂情况下使用的完整剂量所赋予的功效。因 此，疫苗生产实体能够以同样的生产能力生产大量疫苗剂量。同样，可以建议现有条件用于 接种更大数量的动物；
[0007] -减少提供疫苗保护所需的免疫次数。
[0008] 预防病毒、细菌或寄生虫来源的传染性禽类疾病对支持家禽生产的发展极其重 要。接种是用于预防禽类物种大量疾病（如新城疫、禽流感、传染性法氏囊病（Gumboro disease)、马立克氏病、球虫病、传染性支气管炎、禽霍乱等）的推荐方法。肉鸡(broiler chicken)至多生活几个月，并在其一生尤其是在其第一天中接受多种疫苗。
[0009] 禽类疫苗可以通过小鸡或成鸡中的皮下或肌内注射、黏膜（口服、鼻内、眼内）、通 过大量施用(雾化吸入法或在饮用水中施用）、或通过在胚胎达到受精后18或19天时注入卵 (卵内施用)来施用。
[0010] 经可注射途径的接种常规用于施用禽类疫苗。但是，由于在集约农业条件下接种 非常大数量的动物代表高人工成本，最近发展了新方法。卵内接种因此是越来越提倡的疫 苗施用方法，因为它可直接应用于养殖场所(孵化场），且允许大幅减少用于接种的成本和 时间。
[0011] 用于禽类疫苗组合物的抗原可以由灭活病原体(灭活疫苗）、毒力降低的活病原体 (活减毒疫苗）、重组免疫原性蛋白质（亚单位疫苗)或重组活载体(载体疫苗)组成。活减毒 疫苗和载体疫苗一般足够有效而无需佐剂的系统加入，虽然可能用描述于例如美国专利申 请W0 2011/117507中的适宜佐剂放大活疫苗的功效。相反，灭活和亚单位疫苗的配制一般 需要加入免疫佐剂，以达到所需的疫苗功效。
[0012] 目前卵内施用的市售疫苗是不含佐剂的活减毒疫苗。由于活减毒疫苗可具有毒力 回复风险，发展用于卵内接种的灭活或亚单位疫苗是有利的。但是，广泛用于在小鸡或成鸡 中通过注射施用的，包含灭活或亚单位抗原和油包水型油性佐剂的禽类疫苗组合物不能就 这样用于卵内施用。这是因为广泛用于接种小鸡和成鸡的油性佐剂对卵中胚胎的发育具有 毒性。因此需要发展允许卵内使用灭活抗原的特异性佐剂。
[0013] 预期卵内施用的佐剂因此必须具有以下具体特征：
[0014] -对禽类胚胎的发育无毒性；
[0015] -与活减毒(非杀病毒)疫苗相容；
[0016] -按照前述方式提高由疫苗抗原赋予的保护。
[0017]已针对卵内接种测试了多种佐剂技术，如氢氧化错盐，卡波姆型（carbomer type) 聚合物，生物来源的佐剂如CPG、细胞因子和趋化因子，及皂苷。但是，没有一致性，仍有必要 以与卵内接种相容的成本，发展新的有效的佐剂制剂。
[0018] 对于可在小鸡或成鸡中注射的禽类疫苗，最有效的佐剂技术是由水相和基于矿物 油的油相组成的油包水乳剂。但是，迄今未发现基于油性乳剂的佐剂对卵内接种有效，尤其 是由于毒性问题。
[0019] 之前已显示水包油乳剂或微乳类型的佐剂与活疫苗相容，且可以用作用于活疫苗 的免疫佐剂(专利申请W0 2011/117507)。但是，在这些技术中，已显示此家族的大多数佐剂 对卵中胚胎发育有毒性。
[0020] 因此，需要使用包含水包油乳剂的佐剂，该水包油乳剂具有所需特征，如：
[0021] -对鸡胚发育无毒性；
[0022] -能够提高由卵内施用的用于禽类接种的亚单位抗原所提供的保护。
[0023] 因此，本发明的主题是预期在用于卵内接种禽类物种的疫苗组合物中用作佐剂 的，包含至少一种矿物油、具有表征为HLB值等于12的亲水性质的表面活性剂及二价无机盐 的组合物，其特征在于该组合物是水包油乳剂或微乳。
[0024] 此外，本发明的实施方案可以包含一种或多种以下特征：
[0025] 上文定义的组合物，其包含(对于其重量的100%):
[0026] -50 %至97 %的水，更尤其是70 %至97 %的水，甚至更尤其是80 %至97 %的水；
[0027] -1 %至45 %的油性佐剂，更尤其是1 %至30 %的油性佐剂，甚至更尤其是2 %至 10%的油性佐剂；
[0028] -0.1 %至10 %的至少一种二价无机盐，更尤其是0.1 %至8 %的至少一种二价无机 盐，甚至更尤其是〇. 2 %至3 %的至少一种二价无机盐；
[0029] -〇%至10%的至少一种络合剂（complexing agent)，更尤其是0%至8%的至少一 种络合剂，甚至更尤其是〇 %至3 %的至少一种络合剂。
[0030] 上文定义的组合物，其特征在于该油性佐剂包含(对于其重量的100% ):
[0031] -40 %至95 %的至少一种矿物油，更尤其是50 %至95 %的至少一种矿物油，甚至更 尤其是50 %至90 %的至少一种矿物油；
[0032] -5 %至60 %的至少一种表面活性剂，更尤其是5 %至50 %的至少一种表面活性剂， 甚至更尤其是10%至50%的至少一种表面活性剂。
[0033]上文定义的组合物，其特征在于该至少一种二价无机盐选自葡萄糖酸锰、葡萄糖 酸钙、天冬氨酸钙、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸亚铁和氯化钙。
[0034]上文定义的组合物，其特征在于该至少一种络合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、葡 萄糖酸钠、葡萄糖酸钾和聚丙烯酸钠。
[0035]上文定义的组合物，其特征在于该表面活性剂是乙氧基化糖酯。
[0036] 上文定义的组合物，其特征在于该矿物油是可注射质量的白色液体石油膏 (petroleum jelly)。
[0037] 根据另一方面，本发明的主题是预期用于卵内接种禽类物种的疫苗组合物，其包 含至少一种抗原和上文定义的免疫佐剂组合物。
[0038] 此外，本发明的实施方案可以包含一种或多种以下特征：
[0039]上文定义的组合物，其特征在于该抗原包含至少一种重组亚单位蛋白质。
[0040] 上文定义的组合物，其特征在于对于防止禽球虫病的目的，该亚单位蛋白质是来 自艾美球虫属(Eimeria)的蛋白质，更尤其是来自堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)的 蛋白质，且更尤其是抑制蛋白3-1E。
[0041] 上文定义的组合物，其特征在于对于防止坏死性肠炎的目的，该亚单位蛋白质是 来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的蛋白质，更尤其是NetB毒素、或α毒素、或 蛋白质丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶(PF0)、或延伸因子Tu(EF-Tu)。
[0042] 上文定义的组合物，其特征在于对于防止禽球虫病和禽坏死性肠炎的目的，该抗 原包含至少一种来自产气荚膜梭菌的蛋白质，更尤其是NetB毒素、或α毒素、或蛋白质丙酮 酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶(PF0)、或延伸因子Tu(EF-Tu)，及来自艾美球虫属的蛋白质， 更尤其是来自堆型艾美球虫的蛋白质，且更尤其是抑制蛋白3-1E。
[0043] 上文定义的组合物，其包含至少一种球虫病的抗寄生虫活抗原。
[0044] 上文定义的组合物，其包含至少一种用于禽类接种的活抗原。
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