一种w/o型疫苗油佐剂制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疫苗技术领域，尤其涉及兽用疫苗领域中均一、可控的w/ο型疫苗油佐剂制剂及其制备方法，可用于提高制剂稳定性，诱导快速免疫应答以及提升免疫应答强度和水平。
【背景技术】
[0002]随着经济全球化进程的加快，动物及动物产品的流通越来越频繁，动物疫病的传播媒介不断增多，发病和病害流行的几率显著增加，在造成经济损失的同时，也严重危害了人类的健康和生命安全。据不完全统计，近20年来，新增加的动物疫病就有10余种，其中猪蓝耳病、猪伪狂犬病、圆环病毒等疫病均对我国的养猪业造成了较大影响。2004年以来全球蔓延爆发的高致病性禽流感疫情更是对我国养禽业发展构成了严重挑战。近十年来，虽然我国畜牧业的产值平均以10%的速度增长，但是因疫病造成的畜禽死亡率，比西方国家至少高出I倍多，严重制约了现代畜牧产业的发展。如猪传染性疫病中因呼吸道引起的疾病特别突出，发病率达30 %?60 %，死亡率达5 %?30 %。而疫苗发展是积极有效防控动物疫病的策略之一。
[0003]目前已发展的动物疫苗包括活疫苗(弱毒疫苗、基因缺失疫苗、载体疫苗和病毒抗体复合物疫苗)和灭活疫苗(灭活病毒疫苗、化学合成疫苗、分泌抗原疫苗、基因工程亚单位疫苗、抗独特型抗体疫苗和免疫复合体疫苗)。随着生物技术的快速发展，一些新型疫苗不断研制成功，推动了免疫佐剂研制的发展。免疫佐剂是指先于抗原或与抗原同时，或与抗原混合后注射动物，能非特异性增强机体对抗原免疫应答的物质。目前，在兽用疫苗中应用和发展的佐剂包括化学类免疫佐剂(如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、水花生油乳剂、吐温-80、司盘、左旋咪唑和脂质体等)、微生物类免疫佐剂(如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D和短小棒状杆菌)、植物类免疫佐剂(如茯苓多糖、红花多糖、酵母多糖、香菇多糖和中草药类等)、生化类免疫佐剂(如胸腺肽、转移因子、白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子等)、抗生素类免疫佐剂(如红霉素和伊维菌素)，聚合物微球载体、硒、维生素(如维生素E、D、C)免疫刺激复合物(1SC0MS)等也在作为免疫佐剂被研究。
[0004]在众多佐剂中，矿物油佐剂是兽用疫苗尤其是禽类疫苗中应用最多的佐剂。以矿物油为佐剂的疫苗制剂中，通过乳化过程将抗原包覆于油滴中，油滴发挥了抗原储库作用，在注射部位持续释放抗原，防止抗原从注射部位的快速清除，诱导高效、持续的免疫应答水平。因此，油佐剂制剂中抗原在注射部位的释放行为是影响抗原特异性免疫应答强度、水平和持续时间的关键。
[0005]抗原的释放行为与乳液的性质密切相关，包括乳滴粒径大小、乳液粒径分布和油相组成等。基于奥氏熟化理论，乳液粒径分布的不同，会导致其储存稳定性的差异，粒径分布越不均一，越容易发生小粒径乳滴逐渐瓦解、大粒径乳滴逐渐长大，而大乳滴长大到一定程度又会发生破裂，因此在小液滴瓦解和大液滴长大的融合过程中，伴随着抗原的释放；而乳滴尺寸越均一，稳定性就越好。由此可以看出，粒径分布的差异会导致抗原释放行为的差异。而这种差异会进一步导致体内免疫效果的差异。本发明旨在兽用疫苗油佐剂疫苗制剂中建立一种新型的乳液制备方法即快速膜乳化法，制备粒径均一、可控的油佐剂疫苗制剂，克服传统高速搅拌、均质乳化、超声等方法制备的乳液粒径不均一、不可控、批次间重复性不佳的问题；同时，在粒径均一的基础上获得高效、持续的免疫应答效果。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种尺寸均一、可控、免疫应答水平高、免疫应答持久的W/O型疫苗油佐剂制剂及其制备方法。本发明提供的W/Ο型疫苗油佐剂制剂尺寸均一、可控，乳液均一性的提高有利于乳滴稳定性增强，奥氏熟化过程比传统方法制备的乳液更慢，进而使其在注射进体内后，抗原突释低，而后期抗原持续释放，诱导快速、高效、持续的免疫应答水平。
[0007]为实现本发明的目的，采用以下技术方案:
[0008]在第一方面，本发明提供一种W/Ο型疫苗油佐剂制剂，所述制剂为W/Ο型乳液，其中水相为含有抗原的溶液，油相包含白油、乳化剂和稳定剂；所述W/ο型乳液的平均粒径在0.1-8.22 μ m之间，分散系数(PDI)小于0.1。
[0009]本发明提供的乳滴尺寸均一、可控的W/Ο型疫苗油佐剂制剂，其乳滴的粒度分散系数(PDI)小于0.1，粒径在纳米级至微米级可控，可有效提高储存稳定性并降低突释。该均一乳液可稳定储存6个月以上不发生分层，抗原在前2天几乎不释放，后期能持续释放4周或更长时间。
[0010]本发明中，所述roi的定义为:多分散系数，代表乳滴均匀分散的程度，即粒度分布系数。该数值越小，乳滴分布越均匀。相反地，该数值越大，乳滴分布越宽泛。一般认为PDI小于0.1的乳液具有单分散性。
[0011]作为本发明的优选方案,所述W/Ο型乳液的平均粒径在0.59-8.22 μ m之间，优选0.59-5.0 μ m 之间。
[0012]作为本发明的优选方案，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的I种或至少2种的组合。需要说明的是，这里列举的抗原仅是几种典型但非限定性的实例，本领域的技术人员应当理解本发明的W/Ο型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性，可采用各种抗原。
[0013]作为本发明的优选方案，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5?6.0之间的表面活性剂。
[0014]优选地，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的I种或至少2种的组合。需要说明的是，这里列举的乳化剂仅是几种典型但非限定性的实例，本领域的技术人员应当理解本发明的w/o型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性，可采用各种制备乳液常用的乳化剂。
[0015]作为本发明的优选方案，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的I种或至少2种的组合。需要说明的是，这里列举的稳定剂仅是几种典型但非限定性的实例，本领域的技术人员应当理解本发明的W/Ο型疫苗油佐剂制剂及其制备方法具有普适性，可采用各种制备乳液常用的稳定剂。
[0016]在第二方面，本发明提供一种制备第一方面所述的W/Ο型疫苗油佐剂制剂的方法，包括以下步骤:
[0017](I)将含有抗原的溶液作为水相分散于包含白油、乳化剂和稳定剂的油相中，获得w/0(油包水)型预乳液；
[0018](2)将所述W/Ο型预乳液转移至快速膜乳化的储料罐中，在0.l_2.5MPa压力下过微孔膜，得到所述W/ο型疫苗油佐剂制剂。
[0019]本发明提供的乳滴尺寸均一、可控的W/Ο型疫苗油佐剂制剂，其粒径大小可通过所选用的微孔膜的孔径实现控制，其粒径均一性可通过过膜压力和过膜次数进行优化调控。
[0020]上述制备方法中，所述压力可在0.1-2.5MPa之间调节，这主要由制备过程中使用的微孔膜孔径的大小及目标乳液大小的制备要求所决定。
[0021]作为本发明的优选方案，所述步骤⑴中水相与油相的体积比为1:1?1:10。在此范围内形成的W/ο型预乳液稳定性高，利于下一步过微孔膜的操作。
[0022]作为本发明的优选方案，所述抗原选自禽流感灭活病毒、新城疫灭活病毒、猪圆环病毒和口蹄疫病毒中的I种或至少2种的组合。
[0023]优选地，所述乳化剂为亲水亲油平衡值在3.5?6.0之间的表面活性剂。
[0024]优选地，所述乳化剂选自Span60、Span80和Span83中的I种或至少2种的组合。
[0025]优选地，所述稳定剂选自硬脂酸、硬酯酸铝和单硬酯酸甘油酯中的I种或至少2种的组合。
[0026]本发明的制备方法中，所述预乳液粒径大小最好大于膜孔径，预乳液的制备方法，可通过均质乳化、超声乳化、机械搅拌或磁力搅拌等常规方法制备。
[0027]本发明的制备方法中，所述的微孔膜可选择选亲水性膜，如玻璃膜、聚碳酸酯膜、纤维膜或陶瓷膜等。在制备过程中，可通过选择不同孔径的微孔膜来控制乳滴的粒径大小，常用的微孔膜孔径为0.5-50 μ m,更优选为0.8-9.2 μ m。
[0028]本发明方法制备效率很高，预乳液过膜时的流速大小高达1ml.s \因而制备过程大多瞬间完成。
[0029]本发明的制备方法中，所述的步骤(2)中过微孔膜可