一种共表达分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗的制作方法

专利名称：一种共表达分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种与分子佐剂共表达的预防亚洲 1型和A型口蹄疫蛋白工程疫苗的制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将不同亚洲 1型和A型口蹄疫主要外膜蛋白VPl和VP2多个B细胞抗原表位，杀伤性T细胞抗原表位 (CTL表位)，多个T细胞辅助抗原表位(Th表位)与分子佐剂多肽(IFNa)串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到共表达的免疫效果增强型口蹄疫二价蛋白工程疫苗以及该疫苗在预防重大动物疾病口蹄疫中的应用。
背景技术：
口蹄疫是全球最重要的经济动物疾病之一。该病高度感染，通过接触或空气迅速传播。由于口蹄疫高度传染的特性，为了禁止引入口蹄疫和参加国家贸易，无口蹄疫国家对疫情国家保持严格的检疫和进口动物限制。在口蹄疫流行国家，对敏感家畜接种高效力、安全、成本有效地疫苗是控制口蹄疫的基本要求。口蹄疫可以通过动物卫生措施和疫苗接种进行控制，但是由于存在多种病原血清型，包括野生物在内的多种宿主和极端感染性，控制口蹄疫变得很困难。尽管现代集约化家畜养殖体系不允许口蹄疫发生，但是口蹄疫通常不致命，在许多发展中国家并不优先控制，这就为口蹄疫的传播留下了传染源。较好的诊断方法尤其是较好的疫苗能显著的提高世界上无口蹄疫国家和部分疫情国家的控制能力。特别是，高热稳定性和长免疫期的疫苗将有助于控制疾病，减少对先进兽用基础设施的依赖(David J. Paton et al，2009)。人类有意识并试图控制口蹄疫可以追溯到几个世纪以前，Loeffler and Frosch研究表明口蹄疫病毒是第一个哺乳动物病毒病病原(BlancOu，2002)。全病毒灭活苗是传统的用于口蹄疫控制计划疫苗，在控制疫病方面取得了巨大的成功。然而，与目前疫苗有关的问题包括对生产疫苗病毒高防护设备的要求，发生抗原变异导致的众多血清型和血清亚型，以及疫苗不能快速的产生免疫保护力，如果病毒灭活不彻底或者减毒不充分，就会引起口蹄疫暴发增加等，促使研究人员去开发更有效的疫苗，为病毒感染早期阶段提供更好的保护。合成口蹄疫疫苗将消除传统疫苗制备过程中病毒处理的各方面的不足，免疫接种合成疫苗被视为是最理想的选择。目前所设计的和正在研究的诸多基因工程疫苗仍存在许多问题和不足。在许多疫苗设计的抗原成分中仍含有大量与特异性免疫诱导无关的成分， 如免疫抑制和自身免疫等免疫病理成分，而这些成分正是引起局部或全身不良反应的重要因素。有学者单克隆抗体技术研究了 VPl的多个抗原位点，更进一步的抗原位点来自 VP2和VP3。因此，所有的口蹄疫病毒衣壳蛋白编码序列都值得关注(Iteddy G R, 1999 ；Stram Y，1994)。VPl蛋白成为相当多的研究和结构分析的首选蛋白，已经发现VPl能够引起猪体内中和抗体反应，并且能够保护猪和牛免受FMDV的感染。Kleid D. G. (1981)等报道了生物合成融合多肽TRP LE和VPl多次免疫保护牛和猪能够抵抗FMDV攻毒。对应FMDV VPl多肽141-160和200-213区域化学合成了多肽表明这些肽能够使豚鼠和兔产生高水平中和抗体(W08303547,1983)。有学者对已有的口蹄疫病毒分离株进行了序列对比发现亚洲1型分离株的核衣壳蛋白编码序列均观察到密码子变化，但是编码VPl蛋白的变化频繁，编码VP4蛋白的很少变化(Acharya R et al,1989 ；Lea S et al，1994)。VPl构成病毒表面的大部分，很多氨基酸替换部不会损害结构限制，而VP4位于病毒粒子内部，由于受到结构限制，氨基酸序列在型间是保守的。但是亚洲1型VP4蛋白偶尔缺少第6或第7残基，这一点与A、0和SAT型口蹄疫不一致(Reddy G R, 1999 ；Stram Y，1994)。关于VPl表位，涉及了 B-C，E_F和G-H坏以及C-末端。G-H坏和C末端是主要的抗原位点(Brown F，1995)。B-C坏影响G-H坏的空间构象(Parry N，1990)。VP2的内部典型差异主要集中在B-C坏和E-F区的βΑ2禾口 αΖ处(Mateu MG，1995)，它们以helix A和 G-sheet形式存在，是A，0，SAT型口蹄疫病毒的中和位点。VP3的内部典型差异主要涉及E-F 坏和G-H坏和的β D区，是A，0，SAT型的抗原位点，VPl和VP3碳末端的序列异质性进一步增加，这对于蛋白酶翻译后蛋白加口是很显著的(Ryan M D，1997)。抗原位点的胰蛋白酶抗性表明其位于VPl的外面。其活性与VP2B-C坏抗原位点序列有关(Marquart 0 et al，2000)。 VP2的氮末端发现在病毒晶体里是无序的，表明其在病毒表面，这是胰蛋白酶敏感的先决条件。N末端在位置2和3是带有赖氨酸的型间保守序列。在SDS-PAGE结果中，胰蛋白酶处理过的VP2蛋白不同于未处理过的VP26trohmaier K，1982)。Zhang Z W et alQOlO)使用生物信息学与分子生物学结合方法，筛选并确认亚洲1型口蹄疫病毒VPl蛋白的6个VP1-VP4
抗原表位，vpi :ittttgesadpvt12, vpi :17nyggetqtarrlh29，vpi :194ttqdrrkqeiiApekqtl211，
vp2 :40edavsgpntsg50 vp3 :26ygkvsnpprtsfpg39, vp4 :3(iyqnsmdtql⑶n41目前仍然需要一种以合成肽为基础的二价或二价以上FMDV疫苗，在效力和广度方面要优于经典疫苗。本专利的目的就是提供一种合成肽二价FMD疫苗满足这一需求。用来实现这一目标的方法如下(1)确定高亲和表位的有效程序；( 通过化学合成方法，合成编码口蹄疫疫苗作为扩大的b细胞与t细胞表位的全部多肽核酸序列；(3)通过b细胞目标表位与强效T辅助细胞表位结合来增强B细胞的免疫原性，同时调节T辅助表位适应群体变异免疫反应。(4)通过引进循环约束使理想的空间构象特征稳定。混合Th表位能够激发有效地T细胞辅助作用，能够与本身免疫原性弱的B细胞表位结合形成有效地肽免疫原。粘心设计的混合Th/B细胞表位嵌合肽能够诱发Th应答和在多数表达多样化MHC单倍体遗传多样化群体成员中随之产生的抗体应答。这种混合Th能通过有效病毒或细菌源免疫原特异性序列衍生而来，包括麻疹病毒F蛋白，乙型肝炎病毒表面抗原，沙眼衣原体外膜蛋白等。许多已知的Th已表现出有效地增强弱免疫原(U.S.pat. No. 5759551)。强效的Th表位大小范围为15-50个氨基酸残基(U. S. pat. No. 5759551)，通常具有共同的结构特征，可能包含特异的标志性序列。例如，一个共有特征就是两性螺旋， 为带有疏水氨基酸残基的α螺旋，控制螺旋的一个方面，带有电荷和极性的残基，控制螺旋的其他方面(Cease etal，1987)。表位通常包括其他主要的氨基酸模板，例如在两个或三个疏水性氨基酸残基后添加Gly或者带电荷的残基，这种模板定义为Rothbard序列。这些表位也遵循1，4，5，8规律，即疏水性氨基酸残基在正电荷的残基带电荷残基后4，5和8 位。由于所有的这些结构都是由共同的疏水，带电荷和极性氨基酸组成，所以每个结构部能够同时存在一个单一的1 表位中(Partidos et al，1991)。如果只是大多数，而不是全部 T细胞表位混合，那么以上描述至少有一种是适合的。这些特征可能纳入理想的人工Th位点的设计，包括SSAL Th表位，其能够在与识别不同MHC分子有关的位点和保持不变的位点上提供简并性。Meister et al列出了可变位点和优选的可用于MHC结合基序的氨基酸 (Meister et al，1995)。例如，W095/11998描述的Th简并表位作为SSAL Thl，就是模仿麻疹病毒F蛋白混合表位(Partidos et al，1991)。SSAL Thl表位设计使用LHRH目标肽串联方式，像麻疹表位一样，SSAL Thl符合Rothbard序列和1，4，5，8规律。肽免疫原通常比蛋白更灵活，趋向于保持任意优选的结构。因此，通过引入循环限制，将其用于稳定肽免疫原。一个正确坏化肽抗原能够模仿和保持目标表位的空间构想，因而在真实的分子位点处激发有活性的抗体(Moore et al，1992)。这一点通过在氨基末端和碳末端加入cysteine残基，并将两个cysteine残基氧化坏化，已经在FMDV VPl优势免疫坏化区代表肽上实现(W0083/03M7)。I型干扰素，α和β干扰素或者α/β干扰素已知具有抗病毒活性，是宿主细胞抵御病毒侵染的第一道屏障(vilcek and sen，1996)。病毒侵染细胞诱导表达分泌α/β 干扰素，干扰素再与相邻细胞的特异性受体结合，通过一系列导致IFNa / β激活刺激基因 (ISGs)激活的事件，启动抗病毒状态。这些基因的产物影响病毒复制循环的不同阶段，不同病毒对不同的ISG产物敏感。IS(is范例具有广泛的特征，包括双链RNA依赖的蛋白激酶 (PKR)，一种合成酶/RNA酶L和Mx。FMD复制对IFNα和β高度敏感，上清液中包括抑制口蹄疫病毒复制的猪和牛干扰素(chinsangaran et al，1999)。为了更加直接地研究IFNa和β对口蹄疫病毒复制的影响，用针对IFNa和β的各自特异性共有序列作为引物，从猪肾细胞(PK)和胚胎牛肾细胞(EBK)扩增出不同动物的IFNa和β。每个IFN克隆进行测序，并用大肠杆菌表达 (chinsangaram etal，2001)。系列稀释后检测干扰素的生物学活性，猪和牛IFNa和β对来自同源物种细胞的FMDV复制具有相似的抑制作用，例如猪肾细胞系(IBRS2)和牛肾细胞 (EBK)。表达的牛或猪IFNa和β也对水疱性口炎病毒(VSV)，脑心肌炎病，和猪瘟病毒具有相似的抗病毒活性。而且，发现猪与牛IFNa和β亦对其他动物细胞中的FMDV复制具有抑制作用(chinsangaram et al，2001)。由于FMDV在细胞培养物中的对IFNa和β处理敏感，I型干扰素可以用于体内抗FMDV试剂。I型干扰素作用迅速，考虑到口蹄疫病毒抗原多样性，使用干扰素将会为所有 FMDV血清型和亚型提供保护。发明概述本发明根据目前主要亚洲1型和A型口蹄疫国内流行株和东南亚流行株的主要外膜蛋白VPl和VP2氨基酸序列，利用相关生物信息学软件对亚洲1型和A型口蹄疫病毒主要外膜蛋白的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析， 再根据表位B细胞与CTL表位位置和氨基酸序列的保守性设计寡核苷酸片段，同时引入有效的通用性Th细胞表位(PADRE)和分子佐剂干扰素I型，将所设计的亚洲1型和A型口蹄疫病毒B细胞表位、CTL表位、Th细胞表位以及干扰素I型多肽串联后在大肠杆菌中共表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的加强型亚洲1型和A型口蹄疫二价蛋白工程疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防亚洲1型和A型口蹄疫的感染。
本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防流行性亚洲1型和A型口蹄疫毒株感染的共表达分子佐剂加强型蛋白工程疫苗多肽及其疫苗组合物。本发明的目的之二在于提供了所述共表达蛋白工程疫苗的构建及获得方法。本发明的目的之三在于提供了能够表达所述口蹄疫多表位疫苗的基因工程菌株。本发明的目的之四在于提供了所述口蹄疫二价蛋白工程疫苗的制备方法。本发明的目的之五在于提供了所述蛋白工程疫苗在预防亚洲1型和A型口蹄疫中的用途。在第一方面，本发明提供了一种用于预防亚洲1型和A型口蹄疫病毒株感染的共表达分子佐剂加强型蛋白工程二价疫苗多肽及其组合物。其含有6个主要亚洲1型和A型口蹄疫流行毒株AF/72，LC/96，AKT/03，Asia-l-JSL, KZ/03, HeNzk/06毒株等主要外膜蛋白 VPl、VP2B细胞表位，1个杀伤性T细胞表位，2个T细胞辅助免疫抗原表位，以及I型干扰素分子佐剂。所述蛋白工程疫苗包括多个B细胞、杀伤性T细胞、Thelper抗原表位以及分子佐剂串联到一起所形成的蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及共表达抗原表位和分子佐剂多肽蛋白所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，或者单独编码分子佐剂IFNa或者IFNi3，或者IFNa/β结合序列。串联可以通过遗传工程方法进行， 蛋白工程疫苗中除了含有主要外膜蛋白VP1、VP2B细胞抗原表位，杀伤性T细胞抗原表位和 Thelper细胞抗原表位以及I型干扰素分子外，还包含非免疫活性物质。所述非免疫活性物质为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。优选在本发明第一方面的多表位疫苗多肽中所述的主要外膜蛋白抗原表位序列分别选自亚洲1型和A型口蹄疫病毒主要外膜蛋白VPl和VP2B细胞、杀伤性T细胞和 Thelper细胞表位，分子佐剂为具有抗病毒活性的α和β干扰素或者α/β干扰素多肽。 恰当的IFN基因为I型IFNa / β，来自任何对口蹄疫敏感的动物，包括任何偶蹄动物如猪、 牛和羊。另外优选，本发明第一方面所述多表位疫苗多肽的氨基酸序列如下(I)A型口蹄疫病毒VPlB细胞抗原表位135aa 173aa(ABel)KYSAASGRTRGDLGQLAARVAAQLPASFNFGAVRATTIHELL(2)A型口蹄疫病毒VPlB细胞抗原表位199aa 213aa(ABe2)DRHKQKIIAPAKQLL ；(3)A型口蹄疫病毒VPl B细胞抗原表位40aa 62aa(ABe3)VKIGNTSPTHVIDLMQTHQHGLV(4)亚洲1型口蹄疫病毒VPl B细胞抗原表位133aa 158aa(AlBel)KTTYGEESSRRGDLAALARRVNNRL(5)亚洲1型口蹄疫病毒VPl B细胞抗原表位197aa 211aa(AlBe2)DRRKQEIIAPEKQTL(6)亚洲1型口蹄疫病毒VP2 B细胞抗原表位65aa 81aa(AlBe3)HLFDffTPNLAFGHCHYL ；
(7)杀伤性T细胞表位(Tce)氨基酸序列为KYKEAKEWL ；(8)T细胞辅助抗原表位为通用T helper表位Thel :ISITEIKGVIV HRIETILF和 The2 =KFVAAffTL KAAA。(9)分子佐剂为牛alpha干扰素，序列为(maIFN α )RQLRRVSPSSCLQDRNDFAFPQEALGGSQLQKAQAISVLHEVTQHTFQLFS
TEGSAAAWDESLLDKLRTALDQQLIDLQACLRQEEGLPGAPLLKEDSSLAVRKYFHRLTLYLQEKRHSPCAWEVVRAQVMRAFSSSTNLQESFRRKD另外优选，在第一方面所述的多肽片段包含1-3个亚洲1型口蹄疫外膜蛋白优势 B细胞表位，1-3个A型口蹄疫外膜蛋白优势B细胞表位，及杀伤性T细胞表位。进一步为一个杀伤性T细胞表位Tce7，1个亚洲1型口蹄疫外膜蛋白VP2B细胞表位，2个亚洲1型口蹄疫外膜蛋白VPlB细胞表位和3个A型口蹄疫外膜蛋白VPlB细胞表位。此外含有2个 Thelper细胞抗原表位和分子佐剂牛IFNa。上述不同的外膜蛋白B细胞和杀伤性T细胞抗原表位以及T细胞辅助抗原表位的排列组合方式在理论上有几十万种，基于疫苗激发免疫反应机理和疫苗本身生物化学特性考虑，优选如下次序较佳地，多肽片段组合次序为maIFNa-Thel-The2-ABel-ABe2-ABe3-AlBel_Al Be2-AlBe3-Tce, Thel_The2_Be卜Be2-Be3-Be-Tc4-Be5-Be6-Tce7_maIFNα ， maIFNa -Bel -Be2-Be3-Be-Tc4-Be5-Be6-Tce7-Thel-The2, Bel-Be2-Be3-Be-Tc4-Be5-Be6-Tce7_Thel -The2-maIFNα，更佳地，多肽片段组合次序为maIFNα -Thel-The2-ABel-ABe2-ABe3_Al Bel-AlBe2-AlBe3-Tce。在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的分子佐剂加强型亚洲1型和A型口蹄疫二价蛋白工程疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列和分子佐剂序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得加强型二价蛋白工程疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如PCR、限制性内切酶酶切，连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本发明中的核苷酸序列如下GGA TCC CGA CAA CTG AGG AGG GTC TCC CCT TCC TCC TGC CTG CAG GACAGA AAT GAC TTT GCA TTC CCC CAG GAG GCG TTG GGT GGC AGC CAG TTG CAAAAG GCT CAA GCC ATC TCT GTA CTC CAC GAG GTG ACC CAA CAC ACC TTC CAGCTT TTC AGC ACA GAG GGC TCG GCC GCT GCG TGG GAT GAG AGC CTC CTG GACAAG CTC CGC ACT GCA CTG GAT CAG CAG CTC ATT GAC CTG CAA GCC TGT CTGAGG CAG GAG GAG GGG CTG CCA GGG GCT CCC CTG CTC AAG GAG GAC TCC AGCCTG GCT GTG AGG AM TAC TTC CAC AGA CTC ACT CTC TAT CTG CM GAG MGAGA CAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA CAA GTC ATG AGA GCCTTC TCT TCC TCA ACA MC TTG CAG GAG AGT TTC AGG AGA AAG GAC GGT GAT ATCCCA GGT TGC MG ATC AGC ATC ACC GAG ATC AAA GGT GTG ATT GTT CAT CGC ATTGAA ACC ATT CTG TTT GGT GGT GCA AAG TTC GTT GCA GCA TGG ACC CTG AAAGCA GCA GCA GGT GGT CCA TCT TGT AAG TAC TCT GCT GCA TCT GGT CGT ACT CGTGGT GAT CTT GGT CAG CTG GCA GCA CGT GTT GCA GCA CAG CTG CCA GCA TCTTTC AAC TTT GGT GCA GTT CGT GCA ACT ACC ATT CAT GAA CTG TTG GGT TCTGGT GAT CGT CAC AAA CAG AAG ATC ATT GCA CCA GCG AAA CAG CTG TTG GGT TCTGGTGTG AAG ATT GGT AAC ACC TCT CCA ACC CAT GTG ATT GAT CTG ATG CAA ACCCAT CAG CAT GGT CTG GTT TGT GCA GCA TAC AAG ACT ACC TAT GGT GAA GM AGCTCT CGT CGT GGT GAT CTT GCA GCA CTT GCA CGT CGT GTG MC MC CGT CTG CCA GGT TCT GGT GAT CGT CGC AM CAG GAA ATC ATT GCA CCA GAG MA CAG ACCTTG GGT TCT GGT CAT CTG TTT GAT TGG ACT CCG MC CTT GCA TTT GGT CAT TGCCAC TAT CTG TGT GCA GCA TAC MG TAC AAA GAA GCG AAA GAA TGG CTG AAGCTT在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码口蹄疫二价蛋白苗核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。在一优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的亚洲1型和A型口蹄疫二价蛋白工程疫苗多肽。在第五方面，本发明提供了一种分子佐剂加强型的亚洲1型和A型口蹄疫二价蛋白工程疫苗的制备方法，其包括以下步骤工程菌发酵表达蛋白工程疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性、 乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。在第六方面，本发明提供了一种用于预防亚洲1型和A型口蹄疫病毒感染的二价蛋白工程疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述口蹄疫疫苗能够预防亚洲1型和A型口蹄疫流行毒株的侵染。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为进口白油佐剂。在第七方面，本发明提供了第六方面所述的共表达分子佐剂加强型亚洲1型和A 型口蹄疫蛋白工程疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射或鼻内接种注射动物，能够表达足够量的IFN提供抗病毒活性，保护动物免于口蹄疫强毒株攻击。 考虑到免疫动物的大小和体重以及IFN类型，免疫剂量可以根据免疫动物而变化。通过试验确定有效剂量为1头份細1 (见实施例六)。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行靶动物攻毒对比试验、实验室安全性试验等，表明本发明所述的二价蛋白工程疫苗是安全的(见实施例四)，保护动物免受亚洲1型和A型口蹄疫病毒感染，试验结果也表明I型干扰素对二价蛋白工程疫苗具有免疫加强作用(实施例五、六)。另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。


下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1为含有分子佐剂IFN α的亚洲1型和A型口蹄疫蛋白工程二价疫苗多肽编码基因的表达载体pPRSETB-FMD (Asl/A) -IFN α示意图。图2为未含有分子佐剂IFNa的亚洲1型和A型口蹄疫蛋白工程二价疫苗多肽编码基因的表达载体pPRSETB-FMD (Asl/A)示意图。图3为限制性内切酶酶切鉴定电泳图。1 :DL2000 DNA Marker ;2 非加强型口蹄疫二价疫苗质粒双酶切；3 分子佐剂IFNα加强型口蹄疫二价疫苗质粒双酶切。图4为疫苗诱导表达SDS-PAGE电泳图。1 非加强型二价苗诱导表达(箭头为目的蛋白)；2 未诱导表达的对照菌；3 蛋白分子量Marker ；4 分子佐剂IFNa加强型二价疫苗诱导表达(箭头所指为目的蛋白)。图5为发酵样品western blot杂交图。1 预染蛋白分子量Marker。2 非加强型二价苗；3 空白对照；4 分子佐剂IFNa加强型二价苗。图6为纯化蛋白Wfestern Blot印迹结果。1 预染Marker ；2 非加强型二价苗蛋白纯化结果；3 分子佐剂IFNa加强型二价苗蛋白纯化结果；4 空白对照。图7为空白对照组炎性病变分值8为分子佐剂IFN α加强型疫苗炎性病变分值9为非分子佐剂加强型疫苗炎性病变分值10为空白对照及分子佐剂IFNa加强型疫苗病毒血症检测结果1 :DL2000 DNAMarker ；2 :AF/72 阳性对照；3 :LC/96 阳性对照；4 阴性对照；5 =AF-CKl-ID ；6 AF-CKl-2D ；7 :AF-CK1-3D ；8 :AF-CK1-4D ；9 :AF_CK2_1D ；10 :AF_CK2_2D ；11 :AF_CK2_3D ； 12 :AF-CK2-4D ；13 =LC-CKl-ID ；14 :LC_CK1_2D ；15 :LC_CK1_3D ；16 :LC_CK1_4D ；17 LC-CK2-1D ；18 :LC-CK2-2D；19 :LC_CK2_3D；20 :LC_CK2_4D；21 =LC-IFNa2-1D ；22 LC-IFN a 2-2D ；23 :LC_IFNa 2—3D ；24 :LC_IFNa 2—4D ；图11为非分子佐剂加强型疫苗病毒血症检测结果。1 :DL2000 DNA Marker ； 2 :AF/72 阳性对照；3 :LC/96 阳性对照；4 阴性对照5 :AF_FMD2_1D ；6 :AF_FMD2_1D ；7
AF--FMD 2--ID ；8 :AF-FMD2-1D ； 9:AF--FMD3--ID ；10:AF--FMD3--ID ；11:AF--FMD 3--ID ；12AF--FMD 3-ID ；13 =LC-FMDl-ID ；14:LC--FMDl--2D ；15:LC--FMDl--3D ；16:LC--FMDl--4D ；17LC--FMD2--ID ；18 :LC-FMD2-2D ；19:LC--FMD 2--3D ；20:LC--FMD 2--4D ； 21:LC--FMD4--ID ；22
LC-FMD4-2D ；23 :LC-FMD4_3D ；24 :LC-FMD4_4D ；图12为分子佐剂IFN α加强型疫苗抗体滴度变化图13为非分子佐剂加强型疫苗抗体滴度变化
具体实施例方式实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本发明的许多变化为本领域的技术人员所熟知。实施例一分子佐剂加强亚洲1型与A型口蹄疫二价蛋白工程疫苗多肽编码蛋白的设计思路综合国内及东南亚多个亚洲1型和A型口蹄疫病毒流行株AF/72，LC/96，AKT/03， Asia-l-JSL, KZ/03, HeNzk/06等毒株的基因组序列，抗原结构、流行病学研究进展，对重组口蹄疫二价蛋白工程疫苗进行了优化设计。本发明利用生物信息学软件对其主要外膜蛋白VPUVP2进行的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析，预测可能的B细胞抗原表位以及杀伤性T细胞表位的基础上，根据表位位置和氨基酸序列的相似性，分析两种血清型多个毒株的共有及特异性抗原表位，并参考GenBank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，进一步分析抗原表位在不同病毒株中的保守性，从而确定与亚洲1型和A型口蹄疫病毒相关的B细胞优势抗原表位多肽各3段，杀伤性T细胞优势抗原表位1段；T细胞辅助抗原表位优势抗原表位2段，将所有表位串联后形成二价疫苗的骨架结构，同时在骨架氮末端加入分子佐剂。该疫苗的总体结构为Molecular Adjuvant(IFNα )-T Helper Epitope I-T Helper Epitope 2~B Cell Epitope 1(A)-B Cell Epitope 2 (A)-B Cell Epitope 3(A)-B Cell Epitopel(Asial)-B Cell Epitope 2 (Asial)-B Cell Epitope 3 (Asial)-Tc Cell Epitope实施例二大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建将实施例一中设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了 BamH I (5’端)和HindIII (3’端)限制性酶切位点，同时将未加分子佐剂的多表位串联核苷酸片段两段亦分别设计亦EcoRI (5’端)和HindIII (3’端)限制性酶切位点，同时送上海英俊生物技术公司合成，作为对照。把这2个片段合成后分别克隆到PMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与设计序列一致(见序列表)。将重组质粒分别命名为 pMD18T-The/A-AsialB/Tc 和 pMD18T_IFN α -The/A-AsialB/tc。用相应的限制性内切酶将两种质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用hvitrogen公司的pRSETB 质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件10 μ 1反应体系，体系内加入2μ 1质粒，限制性内切酶为5个活性单位(New England biolabs)，加入IOX缓冲液1 μ 1，去离子水补齐，37°C酶切1. 5小时。酶切结束后加入1 μ 1 200mM EDTA终止反应。在琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2. 9kb pRSETB质粒、625bp的The/A_AsialB/Tc 片段和1089bp IFN α -The/A-AsialB/Tc片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体片段1 2-3的比例将多表位核苷酸片段单独和表达载体混合，反应体系15 μ 1，由T4DNA连接酶进行连接，16°C连接过夜，获得重组质粒分别命名为 pRSETB-FMD(Asl/A)和 pRSETB-FMD(Asl/A)-IFNα，(见图 1，图 2)，转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS0转化将pRSETB-FMD (Asl/A)和 pRSETB-FMD (Asl/A)-IFN α 置冰上融化，加入 2μ1链接反应液，再次混勻，冰水浴30分钟，42°C 30秒，然后迅速放回冰浴1. 5分钟，加入 Iml LB培养液，370C，静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200 μ ILB培养基重悬菌体；将菌液均勻涂布于含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37°C 恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。鉴定挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37°C，ISOrpm震荡培养12小时，提取质粒，分别使用内切酶BamHI和HindIII以及EcoRI和HindIII进行双酶切，可以切出相应口蹄疫疫苗基因大小片段的克隆，分子佐剂IFNa加强型为1089bp，非加强型为62^p，可初步确定为阳性克隆(见图3)；阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。诱导表达。即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1 100转接，培养3小时后，加入0. 5mMIPTG,继续培养3小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在44. 6KD和27. 8KD分子量处(见图4)，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养， SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Wfestern-blot进一步证实其表达准确性(见图5)； 经过上述构建及鉴定程序后，可将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立，菌种命名为 pRSETB-FMD (Asl/A) /BL21 (DE3, Plys)和 pRSETB-FMD (Asl/A) -IFN α /BL21 (DE3, Plys)。实施例三工程菌的发酵、纯化与乳化发酵取生产菌种，接种于aiil LB液体培养基中(含100 μ g/ml氨苄青霉素)， 37°C，ISOrpm振荡培养12小时活化菌种。再以1 100的接种量接入摇瓶，37°C振荡培养至0D600 = 3，可按10%比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制， 其中不含有任何抗生素。校正溶氧和PH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37. 0°C时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0士0. 1°C， 溶氧控制在20%左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体0D600 = 1. 0 1. 2时流加补料 500ml，补料后1小时加入IPTG (终浓度为0. 5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束， 取样做SDS-PAGE检定表达情况。纯化将收集到的菌体，用包含体洗液1(1% iTriton X-100，20mMTris_cl PH8. 0) 混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4°C，12000rpm离心收集包含体，并用包含体洗液II (1% D0C，4M尿素，20mMTris-cl PH8. 0)混悬二次超声洗涤包含体，二次低温离心收集包含体。包含体沉淀用8M尿素，0. 3% β-ΜΕ，20πιΜ Tris-cl (pH = 8. 00)混勻，室温搅拌4 小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。变性蛋白1 100稀释，复性液用Tris (PH8. 0) 缓冲体系，加入0. 3M精氨酸，4°C搅拌复性M小时。复性液用pH = 8. 0的20mM磷酸缓冲液，0. 5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH = 8. 0的20mM磷酸缓冲液，0. 5M氯化钠，0. 5M 咪唑洗脱；再用 1. 5M(NH4) 2S04、IOOmM EDTA、pH = 8. 5 的 IOmM Na2HPO4 平衡上疏水层析柱，再平衡，用PH = 8. 5的IOmM Na2HPO4洗脱，即得重组口蹄疫疫苗半成品原液。做 SDS-PAGE以及Wfestern blot印记检定纯化产物是否为目标蛋白(图6)。乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至200 μ g/ml。取进口白矿物油佐剂 DU0PRIME(医药级)经121°C，灭菌15分钟，备用。按油相水相=50 50的比例配制， 先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min，然后以5500r/min高速循环乳化9min，制成油包水单相疫苗。实施例四重组蛋白工程二价疫苗安全性试验材料疫苗重组加强型亚洲1型和A型口蹄疫蛋白工程二价疫苗，批号为20100512， 20100515,20100518。试验动物(1)体重350_450g豚鼠8只，18_22g小白鼠17只，购自青岛市药检所。 (2)经乳鼠中和试验检测血清呈口蹄疫抗体阴性的6月龄以上健康牛8头。方法疫苗对小白鼠的安全性皮下注射小白鼠，每只注射0. 5ml，每批疫苗注射5只，共注射15只小白鼠，同时设定2只阴性对照，连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。疫苗对豚鼠的安全性
皮下注射试验用豚鼠，每只注射1ml，每批疫苗注射2只，共注射6只。同时各设定 2只阴性对照，连续观察10天，观测豚鼠的健康状况。疫苗对犊牛的安全性经乳鼠中和试验检测血清呈口蹄疫抗体阴性的牛8头。其中14头用于注射中心所提供的重组蛋白工程二价疫苗，每批疫苗注射2头牛，每头颈部肌肉注射疫苗。同时设立阴性对照2头，每头注射白油佐剂anl，临床观察10天。结果疫苗对小白鼠的安全性试验结果如表1，20100515免疫组1只受试动物第二天体温略有升高，第三天恢复正常，食欲和健康状况无异常，与对照组一致，无死亡发生，可见重组口蹄疫蛋白工程二价疫苗对小白鼠是安全的，见表1。表1疫苗对小白鼠的安全性试验结果
权利要求
1.一种用于预防亚洲1型及A型口蹄疫流行毒株感染的分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗，其含有分子佐剂IFN α多肽，2段T细胞辅助抗原表位多肽，6段亚洲1型和A 型口蹄疫主要外膜蛋白VPl和VP2相关的抗原表位多肽，以及杀伤性T细胞表位多肽。
2.—种核酸分子，其编码权利要求1项所述任一表位蛋白序列。
3.一种载体，其含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的载体。
5.权利要求1所述的分子佐剂加强型二价蛋白工程疫苗，其中所述分子佐剂IFNa氨基酸序列为SIQ ID No. 4，A型口蹄疫病毒外膜蛋白VPl B细胞抗原表位氨基酸序列包括 SIQ ID No. 10，SIQ ID No. 12和SIQ ID No. 14，亚洲1型口蹄疫病毒外膜蛋白VPl B细胞抗原表位氨基酸序列包括SIQ ID No. 16和SIQ ID No. 18，外膜蛋白VP2蛋白B细胞抗原表位氨基酸序列为SIQ ID No. 20 ；杀伤性T细胞表位氨基酸序列为SIQ ID No. 22 ；T细胞辅助抗原表位为通用T-helper表位，氨基酸序列为SIQ ID No. 6和SIQ ID No. 8。
6.权利要求5所述的述分子佐剂IFNα氨基酸编码序列包括SIQ ID No. 3，A型口蹄疫病毒外膜蛋白VPl B细胞抗原表位氨基酸编码序列包括SIQ ID No. 9, SIQ ID No. 11和 SIQ ID No. 13;亚洲1型口蹄疫病毒外膜蛋白VPl B细胞抗原表位氨基酸编码序列包括 SIQID No. 15和SIQ ID No. 17，外膜蛋白VP2蛋白B细胞抗原表位氨基酸编码序列为SIQ IDNo. 19 ；；杀伤性T细胞表位氨基酸编码序列为SIQ ID No. 21 ；T细胞辅助抗原表位氨基酸编码序列为SIQ ID No. 5和SIQ ID No. 7。
7.权利要求1所述的分子佐剂加强型口蹄疫二价苗多肽串联的最优组合为maIF Na -Thel-The2-ABel-ABe2-ABe3-Al Bel-Al Be2_Al Be3_Tce。，具体核酸序列组合为 SIQ IDNo. 3-SIQ ID No. 5-SIQ ID No. 7-SIQ ID No. 9-SIQ ID No. Il-SIQ ID No. 13-SIQ IDNo. 15-SIQ ID No. 17-SIQ ID No. 19-SIQ ID No. 21 ；具体氨基酸序列为SIQ ID No. 4-SIQ IDNo. 6-SIQ ID No. 8-SIQ ID No. IO-SIQ ID No. 12-SIQ ID No. 14-SIQ ID No. 16-SIQ ID No. 18-SIQ ID No. 20-SIQ ID No. 22。
8.权利要求7所述的核酸及氨基酸序列是CGACAACTGAGGAGGGTCTCCCCTTCCTCCTGCCTGCAGGACAGARQLRRVSPSSCLQDRAATGACTTTGCATTCCCCCAGGAGGCGTTGGGTGGCAGCCAGTTGNDFAFPQEALGGSQLCAAAAGGCTCAAGCCATCTCTGTACTCCACGAGGTGACCCAACACQKAQAISVLHEVTQHACCTTCCAGCTTTTCAGCACAGAGGGCTCGGCCGCTGCGTGGGATTFQLFSTEGSAAAWDGAGAGCCTCCTGGACAAGCTCCGCACTGCACTGGATCAGCAGCTCESLLDKLRTALDQQLATTGACCTGCAAGCCTGTCTGAGGCAGGAGGAGGGGCTGCCAGGGIDLQACLRQEEGLPGGCTCCCCTGCTCAAGGAGGACTCCAGCCTGGCTGTGAGGAAATACAPLLKEDSSLAVRKYTTCCACAGACTCACTCTCTATCTGCAAGAGAAGAGACACAGCCCTFHRLTLYLQEKRHSPTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCACAAGTCATGAGAGCCTTCTCTCAWEVVRAQVMRAFSTCCTCAACAAACTTGCAGGAGAGTTTCAGGAGAAAGGACGGTGATSSTNLQESFRRKDGDATCCCAGGTTGCAAGATCAGCATCACCGAGATCAAAGGTGTGATTIPGCKISITEIKGVIGTTCATCGCATTGAAACCATTCTGTTTGGTGGTGCAAAGTTCGTTVHRIETILFGGAKFVGCAGCATGGACCCTGAAAGCAGCAGCAGGTGGTCCATCTTGTAAGAAWTLKAAAGGPSCKTACTCTGCTGCATCTGGTCGTACTCGTGGTGATCTTGGTCAGCTGYSAASGRTRGDLGQLGCAGCACGTGTTGCAGCACAGCTGCCAGCATCTTTCAACTTTGGTAARVAAQLPASFNFGGCAGTTCGTGCAACTACCATTCATGAACTGTTGGGTTCTGGTGATAVRATTIHELLGSGDCGTCACAAACAGAAGATCATTGCACCAGCGAAACAGCTGTTGGGTRHKQKIIAPAKQLLGTCTGGTGTGAAGATTGGTAACACCTCTCCAACCCATGTGATTGATSGVKIGNTSPTHVIDCTGATGCAAACCCATCAGCAT GGT CTG GTT TGT GCA GCA TAC AAGLMQTHQHGLVCAAYKACTACCTATGGTGAAGAAAGCTCTCGTCGTGGTGATCTTGCAGCATTYGEESSRRGDLAACTTGCACGTCGTGTGAACAACCGTCTGCCAGGTTCTGGTGATCGTLARRVNNRLPGSGDRCGCAAACAGGAAATCATTGCACCAGAGAAACAGACCTTGGGTTCTRKQEIIAPEKQTLGSGGTCATCTGTTTGATTGGACTCCGAACCTTGCATTTGGTCATTGCGHLFDWTPNLAFGHCCACTATCTGTGTGCAGCATACAAGTACAAA GAA GCG AAA GAA TGGHYLCAAYKYKEAKEWCTG L
9.一种非分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗的编码DNA序列。
10.权利要求9所述的非分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗的DNA编码序列是ATCAGCATCACCGAGATCAAAGGTGTGATTGTTCATCGCATTGAAACCATTCTGTTTGGTGGTGCAAAGTTCGTTGCAGCATGGACCCTGAAAGCAGCAGCAGGTGGTCCATCTTGTAAGTACTCTGCTGCATCTGGTCGTACTCGTGGTGATCTTGGTCAGCTGGCAGCACGTGTTGCAGCACAGCTGCCAGCATCTTTCAACTTTGGTGCAGTTCGTGCAACTACCATTCATGAACTGTTGGGTTCTGGTGATCGTCACAAACAGAAGATCATTGCACCAGCGAAACAGCTGTTGGGTTCTGGTGTGAAGATTGGTAACACCTCTCCAACCCATGTGATTGATCTGATGCAAACCCATCAGCATGGTCTGGTTTGTGCAGCATACAAGACTACCTATGGTGAAGAAAGCTCTCGTCGTGGTGATCTTGCAGCACTTGCACGTCGTGTGAACAACCGTCTGCCAGGTTCTGGTGATCGTCGCAAACAGGAAATCATTGCACCAGAGAAACAGACCTTGGGTTCTGGTCATCTGTTTGATTGGACTCCGAACCTTGCATTTGGTCATTGCCACTATTGTGCAGCATACAAGTACAAAGAAGCGAAAGAATGGCTGTAA
11.一种用于预防亚洲1型和A型口蹄疫的药物组合物，包括权利要求1-8所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。
12.权利要求11所述的药物组合在预防亚洲1型口蹄疫及A型口蹄疫中的应用及使用方法。
全文摘要
本发明涉及一种分子佐剂加强型亚洲1型与A型口蹄疫二价苗的制备与应用。所述疫苗含有分子佐剂IFNα多肽，2段T细胞辅助抗原表位多肽，6段亚洲1型和A型口蹄疫主要外膜蛋白VP1和VP2相关的抗原表位多肽，以及杀伤性T细胞表位多肽。本发明还涉及该疫苗的制备及使用方法。动物实验表明，分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗的攻毒保护力明显高于非分子佐剂加强型疫苗。使用本发明所推荐分子佐剂加强型疫苗的免疫剂量，受试动物能够抵御10000ID50剂量亚洲1型和A型口蹄疫强毒攻击，效力实验也表明1头份分子佐剂加强型二价苗至少含有4个PD50的剂量。
文档编号C07K19/00GK102406929SQ201110379549
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者任百亮, 刘甜甜, 刘祯, 张导春, 李殿明, 李毅, 牛纪涛, 田春辉, 蒲勤, 赵明, 顾富香, 齐春梅 申请人:青岛宝麦德生物医药科技有限公司