抗口蹄疫o型（o/gx/09-7）病毒的单克隆抗体组合及检测该病毒的elisa试剂盒、金标纸层 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的单克隆抗体组合、 分泌抗体的杂交瘤细胞株以及该抗体组合在检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒中的应用。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouthDisease，FMD)属一类传染病，俗名 "口疮"、"辟癀"，是 由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthDiseaseVirus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、 热性、接触性传染病，其临床特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。口蹄疫病毒主要 侵害偶蹄兽，偶见于人和其它动物，其主要宿主包括猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生 偶蹄动物等，易感动物多达70多种，最易感染的动物是牛、猪、骆驼、羊、鹿等，野猪、野牛等 野生动物也易感染此病。口蹄疫传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成 巨大政治、经济损失。口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美均有流行，在非流行区也有散发 病例。鉴于此，世界动物卫生组织（法语：〇fficeinternationaldes6pizooties，0IE，也 称"国际兽疫局0ΙΕ)将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的0ΙΕ成员国流行口蹄 疫，时刻威胁着无口蹄疫国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
[0003] 口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水疱，高烧不退，使实 际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和 集体焚毁染病牲畜以绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业 的"头号杀手"。我国对口蹄疫的预防主要通过疫苗注射接种，发生口蹄疫的则捕杀。
[0004] 口蹄疫病毒（FMDV)是偶蹄类动物高度传染性疾病（口蹄疫）的病原，属于微核糖 核酸（小RNA)病毒科（Picornaviridae) 口蹄疫病毒属（Aphthovirus)，其最大颗粒直径为 23纳米，最小颗粒直径为7-8纳米，在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱 基组成，是感染和遗传的基础，周围包裹着的蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学 反应能力，病毒外壳为对称的20面体。
[0005] 目前，口蹄疫病毒在全世界主要有0、六、(：、3六1'1、3六了2、3六了3(即南非口蹄疫病毒1、 2、3型）和Asial(亚洲1型）7个血清型，以及65个以上亚型。各型之间几乎没有免疫保 护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病，因此常常用多价疫苗 来降低患口蹄疫的风险。0型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，我国流行的口蹄疫主 要为0、A、C三型及ZB型（云南保山型）。口蹄疫0型包含多种毒株：0/GX/09-7、0/Mya98/ XJ/2010、0/Mya98/BY/2010、0/JMS/2000 等。其中，口蹄疫 0 型（0/GX/09-7)病毒是由中国 兽医药品监察所提供，属于Cathay拓扑型新猪毒，该毒株株对乳鼠的适应性较好，毒力较 强；在BHK-21细胞上适应性好，遗传稳定；对猪毒力较强；毒株具有较广的抗原谱；1毫升 抗原表达量可达3微克以上，每毫升TCID5。可达10 7·5以上。
[0006]目前，口蹄疫灭活疫苗是预防该病发生的主要有效手段，主要通过将口蹄疫病毒 体外培养后、灭活，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。
[0007]FMDV的免疫是依赖T细胞的B细胞应答，疫苗接种主要诱导中和抗体的产生。疫 苗接种是特异性预防FMDV的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终 消灭FMDV的先决条件。FMDV弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在 预防和控制FMDV的过程中发挥着重要作用。随着分子生物学技术的飞速发展，FMDV基因 工程疫苗如亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫 苗、核酸疫苗等不断涌现。目前，常见的是口蹄疫多种毒株制备的多价疫苗，如口蹄疫〇型 (0/GX/09-7)和口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)混合制备成的双组份疫苗。疫苗生产企业 目前常采用蔗糖密度梯度离心法测量口蹄疫病毒的含量，但是无法对多组份疫苗的某种毒 株进行单独定量。
[0008] 目前，对口蹄疫的检测和诊断，主要基于临床判断以及PCR分子检测。PCR是一个 高灵敏的方法，但特异性存在不足，对口蹄疫的确诊还需要配合核酸测序。因此，这个方法 成本高、操作复杂、对人员的要求也高。
[0009] 基于抗原抗体的免疫学检测，因操作简单、灵敏度高、特异性强、仪器设备便宜等 优点已经被广泛使用在临床检测上。目前，市场上偶见能够检测口蹄疫抗原的酶联免疫 检测试剂盒，但是大都采用了多克隆抗体制成，比如中国农业科学院兰州兽医研究所开 发、生产的0型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒，该试剂盒已经申报专利（专利 号CN103076451A)，该试剂盒采用了 0型口蹄疫的兔抗血清和豚鼠抗血清两种多克隆抗体 制成，但是无法区分0型的不同毒株，比如新疆株（0/Mya98/XJ/2010株）和广西株（0/ GX/09-7株），因而就无法对多组份0型疫苗中的每种0型口蹄疫146S抗原进行单独定量， 其主要的原因就在于多克隆抗体针对多种抗原表位，而不同的血清型尤其是同一血清型的 不同毒株之间可能会存在相同的抗原表位。因此采用多克隆抗体去特异性检测口蹄疫不同 的毒株是不可能成功的，尤其是同一血清型不同的毒株。
[0010] 单克隆抗体因其针对的抗原位点单一，特异性较好，并且生产的重复性优于多克 隆抗体，目前在很多临床检测中被采用。国内偶见有制备口蹄疫单克隆抗体的研究，但尚不 足以应用到口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的检测，获得特异性以及应用性好的单克隆抗体 及能够将其应用于口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒的检测仍是研究人员的努力目标。
【发明内容】
[0011] 本发明的第一个目的是提供用于检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的单克隆抗体 组合。
[0012] 本发明提供的用于检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的单克隆抗体组合，包 括口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和非特异性单克隆抗体 2H10anti。其中：
[0013] 所述特异性单克隆抗体6D6anti其重链可变区具有序列表中SEQIDNo:1的氨基 酸残基序列或将序列表中SEQIDNo:1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取 代、缺失或添加且可与口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒特异结合的多肽，轻链可变区具有序列 表中SEQIDNo: 2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo: 2的氨基酸残基序列经过 一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒特异结合的 多肽。序列表中的SEQIDNo:1由113个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo:2由99 个氨基酸残基组成。
[0014] 编码单克隆抗体6D6anti的基因^D6anti)，其重链可变区编码基因具有序列表 中SEQIDNo:3的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:l的DNA序列或在高严谨条件下可 与序列表中SEQIDNo:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有 序列表中SEQIDNo:4的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:2的DNA序列或在高严谨条 件下可与序列表中SEQIDNo:4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在 0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQ IDNo:3由339个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo:1的氨基酸残基序列的蛋白质， 序列表中的SEQIDNo:4由297个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo:2的氨基酸残 基序列的蛋白质。
[0015] 所述非特异性单克隆抗体2H10anti的重链可变区具有序列表中SEQIDNo:5的 氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo:5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的 取代、缺失或添加且可与口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒非特异结合的多肽，轻链可变区具有 序列表中SEQIDNo:6的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo: 6的氨基酸残基序列 经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒非特异 结合的多肽。序列表中的SEQIDNo:5由117个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo: 6由104个氨基酸残基组成。
[0016] 编码单克隆抗体2H10anti的基因（2H10anti)，其重链可变区编码基因具有序列 表中SEQIDNo:7的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:5的DNA序列或在高严谨条件下 可与序列表中SEQIDNo:7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具 有序列表中SEQIDNo:8的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo:6的DNA序列或在高严 谨条件下可与序列表中SEQIDNo:8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件 为在0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。序列表中的 SEQIDNo:7由351个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo:5的氨基酸残基序列的蛋 白质，序列表中的SEQIDNo:8由312个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo:6的氨基 酸残基序列的蛋白质。
[0017] 含有基因6D6anti和/或2H10anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌均属于本 发明。
[0018] 本发明口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和非特异性单 克隆抗体2H10anti，是以口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒为免疫原免疫小鼠（Musmusculus) 首先获得杂交瘤细胞株6D6和2H10,再由所述细胞株持续、稳定分泌得到。其中能分泌抗口 蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体的细胞株6D6,已于2015年9月16日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo. 11196 ;分泌抗口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的非特 异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H10,已于2015年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCCNo. 11195。
[0019] 获得杂交瘤细胞株6D6或2H10的方法，可包括以下步骤：
[0020] 1)用口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒作为免疫原免疫动物；
[0021] 2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；
[0022] 3)筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株6D6或2H10。
[0023] 获得单克隆抗体6D6anti或2H10anti的方法，是在上述步骤的基础上增加以下步 骤：
[0024] 4)从杂交瘤细胞株6D6或2H10的培养液或接种杂交瘤细胞株6D6或2H10的动物 的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。
[0025] 在上述方法中，步骤1)中的口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒可为活病毒或灭活病 毒，优选为灭活病毒，浓度为10-1000μg/mL;用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、 大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。
[0026] 步骤2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制 备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂（如聚乙二 醇）的诱导下与骨髓瘤细胞（优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。
[0027] 步骤3)中可以在选择性培养基（如HAT培养基）中培养以筛选融合的杂交瘤细 胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性 细胞株。
[0028] 步骤4)中可于体外（如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中）或体内（小鼠腹 水）培养分泌口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒单克隆抗体6D6anti或2H10anti的杂交瘤细 胞株6D6或2H10,并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体6D6anti或 2H10anti〇
[0029] 本发明还提供了所述单克隆抗体组合在口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的ELISA 检测中的应用，是用特异性单克隆抗体6D6anti作为包被抗体，以非特异性单克隆抗体 2H10anti作为酶标抗体的双抗夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：
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