检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的基因芯片以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的基因芯片以 及检测方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD)、猪水泡病（Swine vesicular disease, SVD)和水泡性口炎（Vesicular stomatitis, VS)分别是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus, FMDV)、猪水泡病病毒(Swine vesicular disease virus, SVDV)和水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV)引起的哺乳动物的急 性、高度接触性传染病，这三种类型的病毒都可以感染猪，发病率极高，并能够形成大范围 的流行，能引起严重的公共卫生问题，均被世界动物卫生组织（OIE)列为法定报告动物疫 病。这三种疾病均以猪舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要症状，因此在 临床症状上无法对这三种疾病进行区分，必须通过病原学进行鉴别诊断。
[0003] 目前，对这三种疾病的诊断多采用分离鉴定及常规的血清学方法，所需时间较长， 也有PCR技术的鉴别方法，但还没有建立操作性强且能同时鉴别三种病毒的方法。因此，有 必要建立能同时进行三种疫病快速检测的方法，同时对口蹄疫病毒进行分型检测。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高、可同时检测口蹄疫病 毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的基因芯片和试剂盒。
[0005] 基因芯片，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、CDNA、gen〇mi C DNA、多肽、 抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的 生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本发明检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的基因芯片，其特征在 于：它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :1~5所示 基因片段，用于分别检测口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型、水泡性 口炎病毒和猪水泡病病毒。
[0007] 其中，它还包括阳性对照探针、阴性对照探针，其中，阳性对照探针是SEQ ID NO: 18所示的基因片段，阴性对照探针是SEQ ID NO :17所示的基因片段。
[0008] 本发明还提供了 一种检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的试剂 盒，它包括前述的基因芯片以及扩增试剂；其中，扩增试剂包括SEQ ID NO :6~7、SEQ ID NO :8 ~9、SEQ ID NO :10 ~11、SEQ ID NO : 12 ~13 和 SEQ ID NO : 14 ~15 所示引物对， 用于分别扩增口蹄疫病毒〇型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型、水泡性口炎病毒和 猪水泡病病毒。
[0009] 其中，所述引物对中，SEQ ID NO :6、8、10、12和14所示上游引物与SEQ ID NO :7、 9、11、13、15所示下游引物的摩尔比为1:1。
[0010] 其中，所述SEQ ID NO :6、8、10、12和14所示上游引物标记有荧光染料。
[0011] 本发明还提供了 SEQ ID NO :6 ~7、SEQ ID NO :8 ~9、SEQ ID NO :10 ~11、SEQ ID NO :12~13和SEQ ID NO :14~15所示引物对以及SEQ ID NO :1~5所示基因片段。
[0012] 本发明还提供了 SEQ ID NO :1~5所示基因片段在制备检测口蹄疫病毒0型、口 蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的基因芯片的用途。
[0013] 其中，所述基因芯片还包括阳性对照探针、阴性对照探针，其中，阳性对照探针是 SEQ ID NO :18所示的基因片段，阴性对照探针是SEQ ID NO :17所示的基因片段。
[0014] 本发明还提供了 SEQ ID NO :6 ~7、SEQ ID NO :8 ~9、SEQ ID NO :10 ~11、SEQ ID NO :12~13和SEQ ID NO :14~15所示引物对以及SEQ ID NO :1~5所示基因片段在 制备检测口蹄疫病毒0型、口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒Asia I型、水泡性口炎病毒和猪水 泡病病毒的试剂盒中的用途；其中，五对引物对为扩增试剂，SEQ ID NO :1~5所示基因片 段为检测探针。
[0015] 本发明基因芯片和试剂盒可以同时检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病 病毒，而且能对口蹄疫病毒进行分型检测，特异性强，灵敏度高耗时短，检测快速，可以迅速 掌握畜禽疫病的感染情况临床应用前景良好。
[0016] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0017] 图1芯片矩阵设计
[0018] 图2水化温度优化
[0019] 图 3 封闭液配比优化。1: 0· 5 % BH4Na, 25 % Ethanol ;2: 0· 25 % BH4Na, 25 % Ethanol ;3:0% BH4Na, 25% Ethanol ;4:0. 5% BH4Na, 15% Ethanol ;5:0. 25% BH4Na, 15% Ethanol ；: 0 % BH4Na, 15 % Ethano I ；7:0. 5 % BH4Na, 0 % Ethanol ；8:0. 25 % BH4Na, 0 % Ethanol ；9:0% BH4Na, 0% Ethanol.
[0020] 图4探针筛选矩阵设计
[0021] 图5 口蹄疫0型探针筛选
[0022] 图6 口蹄疫Asia I型探针筛选
[0023] 图7 口蹄疫A型探针筛选
[0024] 图8水泡性口炎探针筛选
[0025] 图9猪水泡病探针筛选
[0026] 图 10 口蹄疫 0 型芯片灵敏度。A: 10-3 ;B: 10-4 ;C: 10-5 ;D: 10-6.
[0027] 图 11 口蹄疫 A 型芯片灵敏度。A: 10-5 ;B: 10-6 ;C: 10-7 ;D: 10-8.
[0028] 图 12 口蹄疫 Asia I 型芯片灵敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0029] 图 13 水泡性口炎芯片灵敏度。A: 10-5 ;B: 10-6 ;C: 10-7 ;D: 10-8.
[0030] 图 14 猪水泡病芯片灵敏度。A: 10-4 ;B: 10-5 ;C: 10-6 ;D: 10-7.
[0031] 图 15 口蹄疫 0 型引物的特异性实验。I :FMDV-0 ;2:FMDV-A ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0032] 图 16 口蹄疫 A 型引物的特异性实验。1:FMDV-A ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-Asia I ; 4:VSV ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0033] 图 17 口蹄疫 Asia I 型引物的特异性实验。：FMDV-Asia I ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ; 4:VSV ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0034] 图 18 水泡性口炎引物的特异性实验。1:VSV ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ;4:FMDV-Asia I ；5:SVDV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9:JEV ； 10!Negative control
[0035] 图 19猪水泡病引物的特异性实验。1:SVDV ;2:FMDV-0 ;3:FMDV-A ;4:FMDV-Asia I ; 5:VSV ；6:PPV ；7:PRRSV ；8:CSFV ；9: JEV ； 10!Negative control
[0036] 图20 口蹄疫0型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaifP醛基基 片；B:北京博奥生物有限公司晶芯"醛基基片
[0037] 图21 口蹄疫A型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaiO*醛基 基片；B:北京博奥生物有限公司晶S?l醛基基片
[0038] 图22 口蹄疫Asia I型不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BW 醛基基片；B:北京博奥生物有限公司晶芯*醛基基片
[0039] 图23水泡性口炎不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaiCW醛基 基片；B:北京博奥生物有限公司晶芯》醛基基片
[0040] 图24猪水泡病不同厂家芯片检测比对。A:上海百傲科技有限公司BaiOK醛基基 片；B:北京博奥生物有限公司晶芯&醛基基片
【具体实施方式】
[0041] 一、实验材料和仪器
[0042] I. 1材料试剂：
[0043]
[0044] I. 2主要仪器
[0045]
[0046] I. 3实验试剂的配制
[0047] 引物稀释：根据合成单，将合成的引物干粉加入适量灭菌超纯水，制成100 μΜ的 引物贮存液，使用时按照