检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测非综合症型耳聋 基因多态性的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 耳聋是一组临床异质性很高的疾病，发病年龄、严重程度及损害部位各不相同， 60%以上的耳聋与遗传因素有关，其中80%为无其他临床症状的非综合性耳聋(NSHI)。人 类基因组计划极大地推动了遗传性耳聋病因学研究，近年来国内外科学家通过大量研究发 现，大多数遗传性耳聋属于单基因病。迄今为止，已发现400多个伴有听觉障碍的综合征，鉴 定出与之相关的遗传缺陷30多个，而在非综合性遗传性耳聋中，已定位了 100多个致病位 点，克隆了70多个耳聋基因。国内自2004年起进行了全国范围的聋病分子流行病学调查，结 果发现21 %的聋人带有GJB2基因突变、14.5%的聋人带有SLC26A4基因突变、3.8%和0.6% 的聋人分别带有线粒体DNA A1555G和C1494T突变，另有6%的正常人群携带致聋突变。其中 GJB2基因的突变与NSHI密切相关，该基因主要功能是编码缝隙连接蛋白C〇nnexin26，与常 染色体显性遗传性耳聋DFNA3和常染色体隐性遗传性耳聋DFNB1也有关，其突变是非综合征 型常染色体隐性遗传性语前聋的主要原因，故称其为耳聋易感基因。GJB3基因也是间隙连 接蛋白基因家族中的一种，该基因突变不仅能导致常染色体显性非综合征型聋，也能导致 常染色体隐性非综合征型聋。临床多表现为高频听力受损的进行性语后聋。SLC26A4基因 (PDS gene)是Pendred综合征（又称耳聋-甲状腺肿综合征）的致病基因，SLC26A4基因与 GJB2基因是常染色体隐性遗传耳聋家庭产前诊断的主要对象。由其突变导致的前庭水管扩 大是内耳最常见的畸形，表现为波动性或进行性感音神经性听力损失，程度达重度到极重 度;发病多在儿童时期，发病前常有颅内压增高的诱发因素。12SrRNA基因与儿科临床联系 较密切，该基因突变的携带者在使用了氨基糖苷类抗生素后极易致聋。12SrRNA基因的遗传 方式为线粒体遗传，特点是女性能将突变的基因传给儿子和女儿，但只有女儿能传给下一 代。故线粒体遗传也称母系遗传。
[0003] 以上这几个基因是我国聋病分子流行病学调查结果，是导致中国大部分非综合征 性遗传性耳聋（NSHI)的几个最常见的致病基因，通过对以上基因进行检测，可以诊断近 60%的遗传性耳聋。检测出耳聋患者及其家属是否携带目前研究的耳聋热点基因，有助于 提高新生儿聋病和高危聋儿的检出率，扩大耳聋的防治与干预范围。对于语前聋患者可以 做到早发现早治疗，尽早利用残余听力配戴助听器或植入电子耳蜗，使患儿聋而不哑;对于 语后聋患者，可以部分预测以后发病的风险和发病的年龄阶段，从而尽早预防，并对患者的 婚配、生育提供遗传信息;对于有线粒体基因突变的患者，可以避免使用氨基糖苷类等耳毒 性药物，防止药物性耳聋。总之，通过基因检测，有利于优生优育，提高人口素质。
[0004] 目前，国内已运用基因芯片技术开展了耳聋基因检测，但其昂贵的检测成本不能 为广大民众所接受。一代测序方法Sanger测序亦可对耳聋基因进行检测，但其也存在着检 测时间长，检测费用昂贵的缺点。
[0005]焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因 型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。本发明 旨在建立一种基于焦磷酸测序技术的快速、准确和高通量的非综合性耳聋相关基因多态性 检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种操作简便、成本低廉、快捷、准确的检测 非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒。
[0007] 本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的应用。
[0008] 为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0009] 一种检测非综合症型耳聋基因多态性的引物，包括如下引物：
[0010] 扩增GJB2基因的引物对:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示；
[0011] 扩增GJB3基因的引物对:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，其下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0012] 扩增SLC26A4-1基因的引物对:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示，其 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示；
[0013] 扩增SLC26A4-2基因的引物对:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示，其 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示；
[0014] 扩增12SrRNA基因的引物对:其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示，其下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
[0015] 其中，SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10的5' 端进行生物素标记；
[0016] GJB2 35 DELG测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0017] GJB2 176-191DEL16测序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:12所示；
[0018] GJB2 235 DEL C测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0019] GJB2 299-300 DEL AT测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0020] GJB3 538 C>T/547G>A测序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:15所示；
[0021 ] SLC26A4 2168A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:16所示；
[0022] SLC26A4IVS7A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:17所示；
[0023] 12SrRNA 1494C>T测序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:18所示；
[0024] 12SrRNA 1555A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:19所示。
[0025] 上述检测非综合症型耳聋基因多态性的引物在制备检测非综合症型耳聋基因多 态性试剂中的应用也在本发明的保护范围内。
[0026] -种检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒，该试剂盒还包括如下试剂：
[0027] (l)DNA 提取试剂；
[0028] (2)PCR反应液：PCR Buffer，MgCl225mmol/L，dNTPs 10mmol/L，Taq DNA聚合酶5U/ yL，甘油，SEQ ID N0:1~10所示的引物lOymol/L;
[0029] (3)单链纯化试剂：体积分数为75%乙醇水溶液，0.2mol/L Na0H，10mmol/L pH 7.6TriS-Acetate水溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
[0030] (4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物 APS，荧光素，dNTP，测序引物SEQIDN0:ll~19 10μmol/L。
[0031] 上述检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒在检测非综合症型耳聋基因多态 性中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0032] -种利用焦磷酸测序技术检测非综合症型耳聋基因多态性的方法，该方法包括如 下步骤：
[0033] (1)提取标本组织中的基因组DNA;
[0034] (2)以步骤(1)中所得基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物，PCR扩增得到 基因片段；
[0035] (3)将步骤(2)得到的基因片段与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
[0036] (4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
[0037] (5)测序结果分析。
[0038]步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为：
[0039] PCR扩增采用50μ1 体系，其中基因组DNA模板2yL，10XPCR buffer 5yL，MgCl24yL， dNTP 3yL，上下游引物各取0.15yL，Taq酶0.3yL，甘油2.5yL，加水补充至50yL;
[0040] PCR 反应条件为：94°C5min; 94°C30s，60°C30s，72°C30s，35 个循环；72°C10min。
[0041] 有益效果:应用焦磷酸测序技术可以快速准确检测耳聋基因的多态性，可广泛应 用于临床上耳聋患者个体化医疗方案制定及预防。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技 术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程;具有高通量、低成本等 特点;PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品 量小。
【附图说明】
[0042]图1为本发明GJB2野生型纯合子(35delG)焦磷酸测序结果；
[0043]图2为本发明GJB2野生型纯合子(176-191dell6)焦磷酸测序结果；
[0044]图3为本发明GJB2野生型纯合子(235delC)焦磷酸测序结果；
[0045] 图4为本发明GJB2野生型纯合子(299-300de 1AT)焦磷酸测序结果；
[0046]图5为本发明GJB3野生型纯合子(538C>T)焦磷酸测序结果；
[0047]图6为本发明GJB3野生型纯合子(547G>A)焦磷酸测序结果；
[0048] 图7为本发明SLC26A4野生型纯合子(2168A>G)焦磷酸测序结果；
[0049] 图8为本发明SLC26A4野生型纯合子(IVS7-2A>G)焦磷酸测序结果；
[0050] 图9为本发明12SrRNA野生型纯合子(1555A>G)焦磷酸测序结果；
[0051 ] 图10为本发明12SrRNA野生型纯合子(14940T)焦磷酸测序结果。
【具体实施方式】
[0052]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0053] 实施例1:试剂。
[0054] (l)DNA 提取试剂：
[0055] 购自 QIAGEN公司。
[0056] (2)PCR 反应液：
[0057]扩增引物SEQ ID NO: 1~10,由上海英俊生物科技有限公司合成；
[0058] PCR Buffer:购自美国Fermentas公司；
[0059] MgCl2:购自美国Fermentas 公司；
[0060] dNTPs:购自美国Fermentas 公司；
[0061 ] Taq DNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。
[0062] (3)单链纯化试剂：
[0063] 75% (v/v)乙醇溶液:购于杭州长征化学试剂有限公司；
[0064] 0.2mol/L NaOH:购于上海试四赫维化工有限公司；
[0065] 10mM Tris_Acetate(pH 7 · 6) :Tris_base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州 化学试剂有限公司；
[0066] 结合缓冲液：由10mM Tris-HCl(Tris_base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化 学试剂有限公司），2M NaCl(购于上海试四赫维化工有限公司），lmM EDTA(购于杭州化学试 剂有限公司），〇· l%(v/v)Tween 20(购于美国Sigma公司）组成；
[0067] 退火缓冲液：由20mM Tris_Acetate(pH 7.6) (Tris-base购于美国Sigma公司，无 水乙酸购于杭州化学试剂有限公司），2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成；
[0068] 亲和素标记的磁珠（购于GE healthcare Bioscience AB)〇
[0069] (4)测序试剂：
[0070] 测序引物SEQ ID N0:11~19,由上海英俊生物科技有限公司合成；
[0071] DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三