一种人类基因组33个基因座的复合扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种同时分析人基因组常染色体及Y染色体基因座的复合扩增试剂 盒，特别设及一种人类基因组33个基因座的复合扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 短串联重复序列(STR)是目前普遍应用的分子遗传标记，其片段小易扩增，适宜于 检验微量和降解生物检材，各基因座的扩增条件相似而能够实现复合扩增和自动化检测， 因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点，非常适用于建立DNA数据库。上世纪90年代美 国FBI选择了13个常染色体STR基因座（简称A-STR)用于建立DNA数据索引系统--CODIS (Combined DNA Index System):CSF1P0、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、 0165539、018551、021511^64、1'册1、1?(^、￥胖4，目前该系统已被多个国家的0魁数据库在其 基础上借鉴和发展。
[0003] 人类Y染色体是小的近端着丝粒染色体，它由长臂和微小的短臂两部分组成。Y染 色体除拟常染色体区外，在减数分裂中不发生交换重组，呈单倍型独立向下传递，表现出父 系遗传特征，其序列的变异完全由累积的突变所致。Y染色体STR基因座(简称Y-STR)是指存 在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列。目前，W各种形式确认并命名的Y-STR基 因座已有220多个，常用的Y-STR基因座有9个欧洲最小单倍型基因座，包括DYS19、DYS385a/ b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393 和 2 个美国 DNA 分析方法技术工作组 (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,简称SWGDAM)推荐的基因座，包 括DYS438、DYS439。将已发现的Y-STR遗传标记与A-STR遗传标记相比，大多数Y-STR遗传标 记具有复杂重复结构，含有两种或两种W上的不同重复单位，群体中个体的核屯、重复序列 或重复次数不同，形成群体遗传多态性。将Y-STR遗传标记的独特性与STR分型检测的优越 性相结合，可应用于个体识别、亲子鉴定、家系排查及家谱构建等。
[0004] 正如上述STR遗传标记及其检测应用的特点，众多科研院所及试剂公司投入大量 人力物力对其进行研究并开发可应用于法医物证的试剂盒产品，如目前国内市场常见的 E邱ressmarker 20巧光检测试剂盒、AGCU Database Y24巧光检测试剂盒W及国外市场的 PowerPlex21System(PP21)和Powerinex Y23System(PPY23)，它们可W分别用于个体识别 检测和父系检测等。通常当一个重大刑事案件发生时，法医会先对现场提取的物证进行A-STR检测，当确认为男性犯罪嫌疑人遗留的物证时，再加做Y-STR检测W增加侦查线索。然 而，因现有的STR分型技术受到检材状态、扩增体系、检测通量等因素的影响，两次检验程序 增加了检测时间而往往延误抓获犯罪嫌疑人的最佳机会，同时由于犯罪嫌疑人遗留在现场 的物证量少导致检测效能降低甚至失败而不能帮助提供更多侦查线索。现有检测试剂盒已 无法很好的满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求，如何实现A-STR 基因座和Y-STR基因座一起检测，达到缩短检测时间同时提高检验效能成为有待解决的问 题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种人类基因组33个基因座的复合扩增试剂盒。
[0006] 本发明所采取的技术方案是：
[0007] -种人类基因组33个基因座的复合扩增试剂盒，所述试剂盒含有用于特异性扩增 33个基因座的33组引物对，33个基因座分别为D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、Penta E、DYS635、DYS456、TPOX、?〇l、D2S1338、CSFlPO、DYS385a/b、DYS458、DYS391、D19S433、vWA、 D21Sll、D18S51、D6S1043、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、DYS438、DYS393、 DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4 及 DYS390，33 个基因座对应的引物对如表1 所示：
[000引表1、各个基因座的引物序列及浓度
[00091
[r''i
[0012] 每个基因座中的至少一条引物的5'端标记有巧光染料。
[0013] 优选的，33个基因座的引物对使用5种不同的巧光染料标记，根据标记的巧光染料 不同分为5组，分别是：
[0014] 0351358、0135317、075820、0165539、？611化￡和0￥5635为第一组；
[0015] DYS456、TP0X、T册 1、0251338、〔5尸1口0、0￥5385曰/6和0￥5458为第二组；
[0016] DYS391、D19S433、vWA、D21Sl 1、D18S51、D6S1043 为第 S组；
[0017] Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、DYS438为第四组；
[0018] 0￥5393、0￥53891、0￥538911、0￥5439、0￥5392、￥_6414_拟及0￥5390为第五组。
[0019] 所述5种不同的巧光染料分别是6-FAM、肥X、TAMRA、R0X和VIG。
[0020] 试剂盒内还包括反应缓冲液、热启动化q酶、超纯水、AlIelic LadderW及巧光分 子量内标，所述反应缓冲液为50ml的Tr i S-肥1、50mM的KCl、2. OmM的MgCl2、0.2mM的dNTPs和 0.8mg/mL的BSA。
[0021] 优选的，试剂盒内聚合酶链式反应的扩增程序为:95°C2min;94°C30s，6rC40s，72 °[1111；[]1，重复15个循环;90°[303,60°[1111；[]1，65°[803，重复15个循环;60°[30111；[]1。
[0022] 本发明的另一个目的在于提供上述人类基因组33个基因座的复合扩增试剂盒在 个体识别、亲子鉴定、嫌疑人家系排查或常染色体数据库及Y染色体数据库中的的应用。
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] 1.本发明包含了公安部DNA数据库推荐使用的18个A-STR基因座，同时涵盖了 14个 突变率低、多态性高的Y-STR基因座，W及Amelogenin基因座，实现单管同时扩增检测33个 基因座，为业内最多；
[0025] 2.本发明实现了一次实验同时分析A-STR及Y-STR两种数据，可同时用于案件的快 速排查，达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率，14个Y-STR基因座对于 案件的排查具有很大的地域、姓氏指向性；
[0026] 3.本发明实现了同建A-STR及Y-STR两个DNA数据库，大大节约了人力物力财力；
[0027] 4.本发明可W检测出大量女性DNA样本背景下的微量男性DNA，是如强奸犯罪等混 合斑检测的有力武器；
[002引5.本发明在检测父-子亲子鉴定时，由于Y-STR数据已包含而无需单独再做Y-STR 实验分析；
[0029] 6.本发明设及一种采用六色巧光标记复合扩增检验系统对DNA样品进行分析的方 法;其中，本发明适用的DNA样品来源于精斑、唾液斑、组织、毛囊、血痕或血液等；
[0030] 7.本发明试剂盒引物通过精屯、设计和不断修改，具有较强的扩增特异性及溫度耐 受性。
[0031] 综上所述，本发明选择了公安部DNA数据库推荐的18个A-STR基因座和1个性别鉴 定基因座，并在此基础上添加了 14个突变率低、多态性较高的Y-STR基因座，实现了 一次实 验同时对常染色体和Y染色体同步扩增和检测。本发明试剂盒可W对W滤纸和FTA卡为载体 的血斑和唾液斑进行直接扩增而无需模板提取和纯化过程，也可W适用于不同提取方法提 取的DM样品，属于国内、外独家产品。本发明试剂盒可用于案件的快速排查，提高检测效率 及案件排查速度，尤其对强奸案中男性样本微量检测及父-子亲子鉴定检测成效显著，本试 剂盒适用范围广，兼容性好，与现有法医DNA检测系统完全兼容。
【附图说明】
[0032] 图1是某公安局提供的编号为9948的对照品的STR分型结果；
[0033] 图2是等位基因分型标准物的电泳图谱；
[0034] 图3是对实际样本检测STR分型结果；
[0035] 图4是对女性样本进行检测时，DYS458基因座出现非特异扩增的分型图谱；
[0036] 图5是对女性样本进行检测时，DYS393基因座出现非特异扩增的分型图谱；
[0037] 图6是对女性样本进行检测时，DYS389Vn基因座出现非特异扩增的分型图谱。
【具体实施方式】
[0038] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员 将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明 具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等 著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第=版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所 用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规产品。
[0039] 实施例1
[0040] 本发明所使用的33个基因座的相应信息如下表2所示：
[0041] 表2、各基因座信息
[r - 一 一
[0044] 上述的基因座中，基因座名称后标记有a/b的为两个基因座。
[0045] 检测试剂盒的主要成分：
[0046] 33个基因座对应的引物对如表3所示：
[0047] 表3、各个基因座的引物序列及浓度
[004只1
[i
[0051] 将所述33个基因座按如下分组并进行巧光标记：D3S1358、D13S317、D7S820、 D16S539、Penta E和DYS635为第一组，巧光染料标记物为6-FAM;DYS456、TP0X、TH01、 D2S1338、CSFlP0、DYS385a/b 和 DYS458 为第二组，巧光染料标记物为皿 X;DYS391、D19S433、 vWA、D21Sll、D18S51、D6S1043为第S组，巧光染料标记物为TAMRA;Amelogenin、D8S1179、 D5S818、D12S391、FGA、DYS438为第四组，巧光染料标记物为R0X;DYS393、DYS389I/II、 0￥5439、0￥5392边4、0￥5390为第五组，巧光染料标记物为￥16。
[0化2] PCR体系各组成如表4所示：