一种体外获能后精子质量评估的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗检测技术领域，具体设及一种体外获能后精子质量评估的方法。
【背景技术】
[0002] 随着社会工业的不断发展，不育夫妇的总发病率明显升高。2004年欧洲生殖学会 统计:育龄夫妇许内不能怀孕者占25%，其中15%寻求治疗，男方因素引起不育占50%。男性 不育的病因有性功能障碍(1.7% )，精索静脉曲张（12. 3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性发 育异常(2.1%)后天获得性疾病(2.6% )，内分泌素乱(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他异常 (3%)，但是高达60%~75%的患者找不到原因，称为特发性男性不育，他们只表现为少精、弱精 或崎形精子症等精子质量异常。不明原因的男性不育可能由于多种因素造成，如长期应激 环境因素引起内分泌素乱、活性氧和基因缺陷等。
[0003] 多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临 床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有=分之 一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把运类患者划为不明原 因不育症。因此，长期W来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。最主要的原因是常规 精液分析只测定精子的数量，存活力，活动率和形态。运些指标只能反映最基本的精液质 量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA损伤，精子与人卵透明带结合反应 与穿透，顶体状况和反应及与卵黄膜结合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能试验才能 测定W上运些功能。精子获能是精卵结合形成受精卵的必要条件，虽然精子获能的相关研 究已有一些进展，但仍然存在很多尚未阐明的问题。
[0004] 临床工作中，一部分原发或继发的不育男性病人利用现有的常规精液质量检查项 目提示精子及精液质量无异常。目前常用的精子检测手段为CASA(计算机辅助精子分析 Computer aided of semen analysis), W及抗精子抗体等。当今最为广泛使用的CASA技术 和一些形态学的相关检测，主要能评价精子的活动能力和活精子比率，从而推测其进入女 性生殖道的受精能力，而依赖目前的精子功能评价体系，对精子质量及功能的评价存在一 定的缺陷，W及难于给病人提供相应的临床咨询。事实上，运仅仅是评价精子功能的一个方 面，我们应该考虑到可能还有影响精子生殖能力的更多没有被掲示的因素。
[0005] 在先专利201310431847.0,提出了一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法。第一 步，通过单精子巧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下巧 光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达;若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步， 利用体外获能液使精子影响精子功能的唾液酸酶检测方法获能，并用巧光法检测唾液酸酶 活性。该专利虽然公开了唾液酸酶蛋白分子在精子中的表达和基本活性的检测。但方法中 包含有精子唾液酸酶NEU1/3的表达检测，需要巧光显微镜或流式细胞仪，存在W下缺点：1) 技术流程复杂;2)对实验设备和操作人员技能和经验要求高；3)不适于应用于临床实验室 和常规技术人员使用;4)使用abeam公司的试剂盒，价格昂贵。另外，由于不同样本的精子数 量不同，表达的蛋白值不同，相应的酶活值也不同，因此，单纯比较不同样本的酶活值并不 科学。
【发明内容】
[0006] 针对上述技术问题，本发明提供了一种体外获能后精子质量评估的方法。通过精 子体外获能后获能液中唾液酸酶活性的检测，评估获能后的精子质量，为临床原因不明的 男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案： 一种体外获能后精子质量评估的方法，其特征在于:具体步骤如下： A、精子的洗涂 收集新鲜液化精液标本，用憐酸缓冲液或者BWW培养液洗涂精子，充分除去残留的精浆 成分，再离屯、分离出精子； 本发明先向精液标本中加入憐酸缓冲液或者BWW培养液进行洗涂，再离屯、分离得到精 子沉淀。运是由于精浆本身黏稠，直接对其离屯、不能使精液中所有精子充分沉淀，加入憐酸 缓冲液或者BWW培养液对其进行稀释后，离屯、操作效果更好。
[0008] 优选地，对精液进行3次离屯、，保证检测没有精浆干扰的情况下，尽可能减少离屯、 精子的次数，保证精子活力。
[0009] B、精子的体外获能 向A步骤分离出的精子中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的C〇2细胞培养箱中培养， 收获上游精子，计数精子数量，用体外获能液在5%的C〇2细胞培养箱中解育精子3~4 h;离屯、 分离，收取的上清液再次离屯、分离，收取上清液作为待测样本;在上游法获得活力较好的精 子后，马上对其进行获能处理，实验结果更科学客观。
[0010] 优选地，控制上游精子数量在IXlO7W上，根据检测灵敏度的需要而设定。
[0011 ] C.精子获能液中唾液酸酶活性的测定 (1)用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯 度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本。
[0012]标准溶液的梯度是根据获能后精子唾液酸酶释放到获能液中的量和本发明方法 所能检测到的灵敏度而设定的。
[OOU]优选地，所述的检现贩为96孔黑板。本发明采用巧光法来测定唾液酸酶的活性，黑 色的检测板对灵敏度和特异性是最佳的，可W保护巧光染料不被光线泽灭，从而使检测的 灵敏度大大提局。
[0014] (2)用检测缓冲液稀释巧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本 的孔内，再将检测板置于37°C，避光解育1-2小时后，用酶标仪读取各孔巧光强度，根据唾液 酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/精子数目的 值即可。
[0015] 优选地，用检测缓冲液稀释至巧光试剂的浓度为0.05mM，为最佳的工作浓度。
[0016] 优选地，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔巧 光强度。365nm为最佳激发波长，450nm为最佳发射波长。
[0017] 优选地，用于检测的孔内样本唾液酸酶活性应在0.3-5mU/ml范围内，如果超出则 应将孔内待测样本的唾液酸酶活性值调整在此线性范围之内。
[001引本发明所述的检测缓冲液为含0.05 mmoL/L乙酸钢和0.25iigAU牛血清白蛋白的 PBS。检测缓冲液的缓冲体系，是针对唾液酸酶活性检测特定配制的。
[0019] 优选地，所述乙酸钢的pH值为5-6，是针对唾液酶活性最佳的工作环境。
[0020] 本发明所述的体外获能液为含HSA (人血清白蛋白）5mg/ml的HTF(人输卵管液）。
[0021] 所述的唾液酸酶标准原液为产气芙膜梭菌唾液酸酶(AUS)，浓度为抓/ml,能方便 的稀释为5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml运些浓度梯度。采用产气芙膜梭菌唾液酸酶适 用于本发明少量精子的检测方法。
[0022] 所述的巧光试剂是y-4-甲基伞形酬基-a-D-N-乙酷神经氨酸钢，具有较高的灵敏 度。
[0023] 所述y -4-甲基伞形酬基-a-D-N-乙酷神经氨酸钢的具体结构如下：
本发明的有益效果在于： 1、本发明检测方法的试剂均选择常规试验试剂，并结合对精子检测的特殊性，降低了 实验成本，所需的仪器设备、耗材种类少，仅为离屯、机、酶标仪、EP管、枪头和检测板等，均为 常规实验室配置;并且操作方法简单，仅为离屯、、加样等，不存在需多次练习才能获得操作 技巧的情况，可广泛应用于临床实验室和常规技术人员使用。
[0024] 2、本发明的检测方式用于评估获能后精子的质量，根据单位精子数量内唾液酸酶 的活性值，作出人群表达唾液酸酶活性的临界值，可在临床上通过单位酶活值更深层次了 解精子功能，可应用于生殖辅助如试管婴儿等技术。
[0025] 3、由于不同样本的精子数量不同，表达的蛋白值不同，相应的酶活值也不同，运样 一来，单纯比较不同样本的酶活值并不科学，因为假使一个样本的精子数目很少，但精子质 量很高，而另一样本的精子数目很多，但精子质量较低，如果单纯比较酶活值，则前者很可 能输给后者，但实际情况是，前者质量要高于后者。因此，本发明的检测的是唾液酸酶活性/ 精子数目的单位酶活值，检测结果更加客观、准确可靠。
[0026] 4、本发明对精子进行充分的洗涂，充分除去残留的精浆成分，使精浆中残留的蛋 白及唾液酸酶不会影响检测结果的准确性;优化了测精子蛋白浓度时设置的标准品蛋白浓 度梯度和测酶活时设置的标准品酶活梯度，如果梯度设置不合理，均会很影响结果的灵敏 度和准确性;使用黑色检测板测酶活，可明显降低光线对巧光试剂泽灭的负面影响，由此大 大提高实验结果的稳定性、灵敏度和准确性;最终的检测结果设计为唾液酸酶活/精子数目 的值，运样可降低不同样本之间的差异，使彼此更具有可比性，保证检测结果的稳定性和可 靠性。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明的质量评估方法分别测定未获能精子和获能精子(A为小鼠，B为人） 的唾液酸酶活性。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合【具体实施方式】对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
[00巧]实施例1 一种体外获能后精子质量评估的方法，具体步骤如下： A、 精子的洗涂 收集新鲜液化精液标本，用憐酸缓冲液或者BWW培养液洗涂精子，充分除去残留的精浆 成分，再离屯、分离出精子. B、 精子的体外获能 向A步骤分离出的精子中加入BWW培养液，采用上游法，在5%的C〇2细胞培养箱中培养， 收获上游精子，计数精子数量，用体外获能液在5%的C〇2细胞培养箱中解育精子化;离屯、分 离，收取的上清液再次离屯、分离，收取上清液作为待测样本； C、 精子获能液中唾液酸酶活性的测定 (1)用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯 度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液和待测样本。
[0030] (2)用检测缓冲液稀释巧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本 的孔内，再将检测板置于37°C，避光解育1小时后，用酶标仪读取各孔巧光强度，根据唾液酸 酶活性标准曲线计算出待测样