专利名称：大白菜控制器官大小基因BrGRF5及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种控制大白菜器官的基因，特别是一种控制大白菜器官大小的 BrGRF5基因及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
发掘和利用与重要经济性状有关的功能基因是实现农作物优良品种培育的有效途径。在作物育种史上，凡是突破性的成就，都与关键基因的利用密不可分。20世纪50年代，由于美国通过对抗胞囊线虫基因的有效利用，从而使得大豆总产量超过中国，跃居世界第一，并一直保持至今；60年代，矮杆基因的应用导致世界粮食的“绿色革命”和粮食产量的飞跃；70年代，袁隆平先生对水稻野生不育基因的改良催生了中国杂交水稻的诞生并轰动世界；90年代，世界种业巨头对重要基因资源系统性地研究和应用导致了他们在中国的迅猛扩张。蔬菜是我们日常生活的必需品。我国政府在确保粮食安全生产的同时，也非常重视“菜篮子”工程的建设。大白菜起源于中国，是我国的特色蔬菜。据调查，在黄河以北地区，秋冬大白菜的种植面积占秋菜种植面积的50%左右，东北地区可达60%左右。大白菜生长期较短，生产成本低、产量高，且价格低，尤其在秋冬大白菜的收获季节，其价格是所有蔬菜中最低的。因此，它适合于城镇中低收入水平的家庭和广大农民的要求，可以算得上是一般家庭的“当家菜”。由于大白菜在我国及东亚国家的蔬菜生产和消费中占有举足轻重的地位，因此，挖掘大白菜重要功能基因并用于遗传改良显得十分重要。器官大小是大白菜的一个重要经济性状。有效利用控制大白菜器官大小的基因， 在分子水平上有目的调控器官的大小和形态，可以满足市场对大白菜的不同需求。因此，控制器官大小在提高大白菜产量和质量方面具有极为重要的意义。不同物种间，植物种子和器官大小有着显著的差异，但在物种内个体之间器官的大小相对一致，说明植物器官的大小是受遗传控制。在植物体中存在着控制器官大小的基因，它们通过协调细胞分裂和生长来决定器官大小。器官大小通常和细胞数目相联系，已有的研究表明在器官发育过程中细胞分裂受严格控制。例如，在烟草中过量表达SUPERMAN 基因可导致细胞数目减少从而造成植株矮小。拟南芥struwwelpeter突变体由于地上器官中细胞数目减少，产生了侏儒表型。拟南芥AINTEGUMENTA (ANT)基因功能缺失突变体减小了叶、花的大小和数目，而ANT基因的异位表达增大了营养器官(如叶和茎)和花器官。 ANT基因主要通过影响总细胞数目和细胞分裂程度来改变成熟器官的大小。该基因并不控制细胞生长速率和细胞周期，而是在器官形成过程中调节器官生长和细胞分裂。这些结果表明ANT基因很可能维持与生长相协调的持续的细胞分裂。ANT基因功能缺失致使细胞有丝分裂减少，细胞生长提前终止，从而使器官减小。相反，ANT基因过量表达的植株能使自身细胞比正常细胞生长和分裂时间更长，因而使器官增大。ANT基因的功能并不仅限于拟南芥，35S: :ANT的表达也使转基因烟草植株增大。ANT基因编码一个具有AP2-domain的转录因子，它的同源基因已经从其它植物中分离出来。油菜BANT基因在拟南芥中异位表达也使拟南芥器官增大，这进一步支持了不同植物中ANT基因在控制器官大小方面具有保守的功能。ARGOS基因在ANT基因的上游起作用并影响器官细胞的分裂能力。表达正义或反义 ARGOS基因的植株器官分别增大或减小，这是因为细胞数目和器官生长持续时间的变化而改变了器官大小。GIFl蛋白是人类SYT转录共激活因子的同源蛋白。通过对GIFl功能缺失突变体以及特异抑制GIFl功能的RNAi转基因拟南芥的研究发现。突变体和转基因植株都产生了较窄的叶和花瓣。较窄的叶是由在叶宽轴方向上的细胞数目减少引起的。这些结果说明GIFl基因参与了调节叶和花瓣的生长和形状。
植物器官的最终大小不仅与细胞数目，而且与细胞体积有关。最近的研究表明，不同的细胞体积或细胞的极性伸长都能导致植物器官大小改变。例如，拟南芥angutifolia 突变体影响叶宽方向的细胞延伸从而产生了较窄的叶。相反过量表达AtEXPIO、ARL和 AtGRFl基因都能促进细胞延伸从而产生较大的器官。R0T3基因调节叶长方向的细胞生长并决定器官长度。由于细胞体积变大，e2ff-l突变体产生了较长的根和下胚轴。拓扑酶VI 突变后导致细胞不能正常扩张从而产生矮小的植株。拟南芥BIGPETAL (BPE)基因编码转录因子，该基因的下调表达促进花瓣细胞扩张从而产生较大的花瓣。GRF是一类转录因子家族，在拟南芥中由9个成员组成。研究发现，过量表达 AtGRFl和AtGGRF2使拟南芥产生了较大的叶和子叶，与野生型拟南芥相比转基因植株抽苔时间延迟。相反，AtGRFl-AtGRF3三突变体产生了较小的叶和子叶，而单突变体没有表型。 转基因植株和三突变体叶的变化是细胞体积的增加或减小引起的。然而，在拟南芥中过量表达AtGRF5同样可提高转基因植株器官的大小，但其机制在于促进或者维持了细胞的分离能力，通过调节细胞数目的多少达到调节植物器官大小的目的。这些结果表明，GRF家族成员可正调控植物器官的大小，但成员之间的调控机制存在一定的差异。因此，如果能够找到控制大白菜器官大小的基因并加以利用，可以对大白菜品质的改良起到非常关键的作用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种控制大白菜营养器官大小的BrGRF5基因及其应用。一种控制大白菜营养器官大小的BrGRF5基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所
7J\ ο一种由上述BrGRF5基因编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。一种插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的载体。一种重组细胞，插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列的载体。上述BrGRF5基因、载体或重组细胞在经济作物生产改良中的应用。有益效果本发明从大白菜中克隆了一个BrGRF5基因，并验证了该基因具有控制植物器官大小的功能，经试验，通过过量表达该基因，可以获得比野生型植株产量更高的转基因作物 (如图1所示)。本发明的基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源。
图1为本基因在拟南芥中过量表达后与野生型拟南芥植株的对比照片；A为野生型植株，B为BrGRF5过量表达的转基因植株。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明做进一步描述，但本发明所保护范围不限于此。实施例基因的分离与转化 以大白菜福山包头10天苗龄幼苗的地上部分为材料，取至液氮预冷的研钵中，力口入液氮快速磨成粉末，将IOOmg粉末装入1.5ml离心管中，加入Iml Trizol (Invitrogen 公司出售)颠倒混勻，室温静置10分钟。在4。C，12000rpm离心10分钟，取上清液移至新的1. 5ml离心管中。加入200 μ 1氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟，室温静置2_3分钟。4°C， 12000rpm离心10分钟。取无色上层水相至一新的离心管中，加入600 μ 1_20°C冰箱预冷异丙醇，颠倒混勻，室温静置10分钟。4。C，12000rpm离心10分钟，吸去上清液。加入Iml 75%乙醇，涡旋震荡。4°C，7500rpm离心3分钟。室温干燥3_5分钟，加入30 μ 1的无RNase 水溶解沉淀，然后置于55°C水浴中溶解10分钟，迅速冰浴5分钟后瞬时离心。利用RT-PCR方法扩增BrGRF5基因的编码序列。具体操作方法如下首先，将mRNA反转录成第一链cDNA，所用反转录酶为Takara公司生产的M-MLV reversetranscriptase,反应体系为 20 μ 1。依次力口入 Ιμ oligo dT>2 μ g RNA 禾口无 RNase水至13. 5 μ 1，在70°C水浴中变性5分钟，迅速冰浴5分钟，瞬时离心，然后依次加入 1 μ 1 IOmM dNTP,4y 15 X RT 缓冲液，0· 5 μ 1 RNase inhibitor 禾Π 1 μ 1 M-MLV reverse transcriptase。轻轻混合均勻，42°C反应60分钟，70°C水浴10分钟使酶失活。以第一链 cDNA为模板扩增目的基因，所用引物为BrGRF5-F 5' -CGGGATCCATGATGAACCTAAGTGGAACTAGTG-3，(SEQ ID NO. 3)BrGRF5-R 5' -TAGTCGACTCAGCTACCAGTGTCGAGTCTTGAC-3，(SEQ ID NO. 4)PCR 反应体系为 25μ 1，依次加入 10XPCR 缓冲液 2· 5μ 1，2μ 1 2. 5mM dNTP, 2μ 1反转录产物，正向引物0.5μ I(IOmM)，反向引物0.5μ I(IOmM)，5U/1 Taq DNA聚合酶 0. 25 μ 1，最后加水至25 μ 1。PCR反应条件预变性94°C 3分钟；变性94°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 2 分钟，30个循环；最后延伸10分钟，4°C保存。琼脂糖凝胶电泳后将PCR产物装入pUC18DNA vector中pUC18DNA vector由 Takara公司产售。将PCR产物与pUC18DNA vector进行连接反应，连接体系10 μ 1，各组分为Ιμ pUC18DNA vector,2y 1 PCR产物，5 μ 1连接酶液，加水至10 μ 1。在16°C水浴中连接30分钟，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。将连接好的载体进行测序，确认正确无误。用Takara公司生产的BamHI和SalI酶切，操作如下酶切体系50μ 1，包括7. 5μ 1 10 X T缓冲液，20 μ 1已插入片段的载体，2 μ 1 BamHI, 2 μ ISalI 禾Π 18. 5 μ 1 水。在 37°C水浴 4 个小时。用杭州博日科技有限公司产售的Biospin Gel Extraction Kit回收基因片段，操作如下用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1. 5ml离心管中。按1 3的比例加入Extraction buffer。于50°C恒温水浴中直到凝胶融化。将混合液全部转入Spin column内，于6000rpm离心1分钟，弃去接液管内液体。向Spin column 中加入500μ1 Extraction buffer，于12000rpm离心1分钟，弃去接液管内液体。向Spin column中加入750 μ 1 Wash Buffer，于12000rpm离心1分钟,弃去接液管内液体。再次于 12000rpm离心1分钟，然后将Spin column转移至无菌的1. 5ml离心管内。向Spin column 中加入50 μ 1 Elution Buffer,并于室温放置1分钟 。12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。将回收的基因片段连接入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-0CS中，操作如下连接体系10μ 1，包括1μ 1 pCAMBIA2300-35S-0CS，5y 1回收的基因片段，1μ 1 10ΧΤ4连接酶缓冲液和ι μ 1 Τ4连接酶，最后加水至 ομ 1，在16°C下连接12小时，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，提取质粒进行鉴定。将构建好的植物表达载体转入农杆菌LBA4404中，操作如下取100 μ 1农杆菌感受态细胞，加入3 μ 1构建好的质粒DNA，冰浴5分钟，液氮冷冻1分钟，37°C水浴5分钟，然后加入Iml LB培养基(1升LB培养基含5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，IOg氯化钠)，28°C， 200rpm振荡3小时。IOOOOrpm离心1分钟，弃上清，加入100 μ 1 LB培养基重悬细胞，涂布于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB平板培养基上(1升LB平板培养基含5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨，IOg氯化钠，15g琼脂)，28°C培养2-3天。选取茎转化后的农杆菌LBA4404，通过浸花法转化拟南芥(Columbia ecotype)。 操作如下将农杆菌菌落接种于5ml LB培养基中，28°C，200rpm振荡过夜。按1/50接种于 200ml含相同抗生素的新鲜培养基中，继续培养至OD6tltl为1. 0,4500rpm离心5分钟收集菌体，重悬于侵染液中。转化所用侵染液含有5%蔗糖，0.03% Tween(吐温)-20。将拟南芥的花序浸入侵染液中30秒钟，把花盆侧放于托盘中，蒙上地膜避光24小时，第二天取下地膜，将花盆直立。制备1/2MS筛选平板(1/2MS培养基加50mg/L卡那霉素，100mg/L羧苄青霉素)， T1代种子茎70%乙醇消毒5分钟，2%次氯酸钠消毒10分钟后播种于1/2MS筛选平板，每板播种IOOyg的拟南芥种子。4°C春化3天后放于培养箱(22°C，16小时光照/8小时黑暗) 中。6天后选出绿色的生长正常的阳性植株，移入蛭石中培养，单株收获T2代种子。繁殖并鉴定T3代，获得纯合的转基因株系10个。基因功能的鉴定T3代纯合体株系和野生型拟南芥种子在冰箱中春化3天，消毒后将种子播于含 50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基平板。于22°C，16小时光照/8小时黑暗培养箱中6天。 待幼苗子叶完全张开后，将转基因株系和野生型幼苗转入蛭石中，然后置于培养间(22°C， 16小时光照/8小时黑暗)中培养。培养30天后观察转基因株系和野生型植株的表型。结果发现转基因株系的各个器官比野生型的对应器官显著增大，具体实验数据请参见表1，说明BrGRF5基因的过量表达促进植物器官增大，从而增加生物量。表1超量表达BrGRF5与对照的比较(P彡0. 05)
权利要求
1.一种控制大白菜器官大小的BrGRF5基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.一种由上述BrGRF5基因编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.—种插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的载体。
4.一种重组细胞，其特征在于，插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ IDNo. 1序列的载体。
5.如权利要求1所述BrGRF5基因、权利要求3所述载体或权利要求4所述重组细胞在经济作物生产改良中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种控制大白菜器官的基因，特别是一种控制大白菜器官大小的BrGRF5基因及其应用，属于分子生物学技术领域。一种控制大白菜营养器官大小的BrGRF5基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明从大白菜中克隆了一个BrGRF5基因，并验证了该基因具有控制植物器官大小的功能，经试验，通过过量表达该基因，可以获得比野生型植株产量更高的转基因作物。本发明的基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源。
文档编号C12N1/21GK102229935SQ20111014945
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者刘立锋, 李利斌, 李化银, 王凤德, 高建伟 申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所