拟南芥过氧化氢酶基因cat的植物表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及拟南芥过氧化氢酶基因以7植物表达载体及其在制备吸收甲醛能力增强的转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002]甲醛(HCHO)被广泛的用于化工合成、工业制造、医药合成等所涉及的化学领域及其他工业领域，尤其是在化学农药及其中间体合成领域甲醛有着举足轻重的作用。现代化学农药的生产过程中不能避免的要产生大量含甲醛的农药生产废水，这些农药生产废水中普遍含有大量的甲醛以及醇、苯、酚、三聚甲醛、甲缩醛等物质，由于废水中甲醛的存在使得其处理变得十分困难。而且按照国家标准《污水综合排放标准(GB8978-1996)》规定:二级排放标准的甲醛含量不得高于2mg/L，所以含甲醛的农药生产废水要直接排放不仅不符合环保要求，并且对动植物都具有严重的危害性。由于甲醛在工业生产中的用途很广，完全的限制是不现实的，所以必须对工业生产中甲醛废水进行无害化处理。另一方面随着生活质量的不断提高装修已成为现代生活的一部分，而装修所用的材料胶合板、细木工板、中密度纤维板和刨花板等含有大量HCH0，这是因为目前生产人造板材使用的多种胶粘剂比如脲醛树脂、三聚氰甲醛、胺基甲醛树酯、酚醛树脂等多以HCHO为主要成分，所以HCHO气体成为装修房间中空气污染的主要化学物质之一。
[0003]HCHO是一种广泛存在的有毒化学物质，它可以溶于水中以液态存在，也可以挥发成为气体以气态形式存在。HCHO可以被还原为甲醇也可以被氧化为甲酸，而这三种物质对生物都具有一定的毒性。其中HCHO由于含有羰基基团因此具有较强的亲电特征，其具有十分活泼的化学性质能与各种脂类、核酸和蛋白质发生非特异性反应，并能导致生物体内各种相关物质失去生物活性。HCHO对人和动物具有较强毒性，它能导致皮肤敏感并能引起皮肤炎症；HCH0也能进入呼吸系统并引起该系统出现变态反应，通过血液循环被运输到全身引起肺部病变、肝脏器官损伤、免疫调节能力下降等。如果我们长期使用含有HCHO的水，会引发胃部不适、免疫障碍、贫血以及引起神经性病变，会对生物体产生急性或慢性的危害。如果人们暂时逗留在含有低剂量HCHO气体的室内时会使人产生不舒服的感觉，而长时间呼吸微量的HCHO会导致慢性呼吸道疾病，鼻咽癌、结肠癌、脑癌、月经紊乱、妊娠综合症、新生儿染色体异常、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连、白血病、青少年记忆力和智力下降等。当房间内HCHO气体浓度升高时，可刺激人眼使人流眼泪并引起咽喉不适或疼痛。而人体接触更高浓度HCHO气体可引起咳嗽、恶心或肺水肿等不良反应，如果HCHO气体浓度达到30mg/m3时可致人死亡。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TD1、VOC等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、危害大等特性。
[0004]H2O2是植物体内的一种抗逆信号因子，在植物体中有双重作用:一方面，适量的H2O2作为一种信号，通过诱导一系列防御机制来保护植物细胞免受氧化胁迫；另一方面，过量的H2O2导致过氧化损伤，对植物体造成伤害。当植物受到外界胁迫，如甲醛胁迫，气体甲醛主要通过植物的气孔被吸收进入植物体内。已有研宄证明甲醛胁迫增加植物叶片中H2O2积累，
逆境信号分子H202、ABA等因素通过影响PM H+ -ATPase的磷酸化水平来影响它与14-3-3蛋白的结合，从而降低PM H+ -ATPase的活性和氢泵活性，降低了跨质膜内部的负电势梯度使K+、阴离子等从保卫细胞中流出，细胞渗透势减小，水分从细胞中排出，膨压减少，细胞收缩，气孔关闭。而CATs作为过氧化物的重要清除剂，可清除积累在植物体内的过量的过氧化氢，减少甲醛胁迫对植物的伤害。因气孔的保卫细胞含有叶绿体，叶绿体是植物细胞H2O2的最大来源处，本研宄尝试利用光诱导型启动子(PrbcS)和叶绿体信号肽(*T)在野生型烟草(WT)叶片的叶绿体中过量表达拟南芥以7；解除过氧化氢大量积累带来的负影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种拟南芥过氧化氢酶基因CA71的植物表达载体pk2-PrbcS-*T-U7；所述载体含有拟南芥以堪因的cDNA、卡那霉素筛选标记基因(Kan )、光诱导型表达启动子(PrbcS )和叶绿体定位信号肽(*T )，以堪因cDNA来源于拟南芥，GenBank登录号为145353262，过氧化氢酶基因CAr cDNA的上游为CaMV 35S的光诱导型表达启动子。
[0006]本发明另一目的是提供一种含有拟南芥过氧化氢酶基因(即以堪因)的植物表达载体pk2-PrbcS-*T-以汹新用途，即其在制备吸收甲醛能力增强的转基因植物中的应用。
[0007]上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为PK2GW7 (购自FlandersInteruniversity Institute for B1technology, VIB)。
[0008]本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的:
1、植物表达载体的构建
(1)从GenBank中查找拟南芥以堪因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物:
上游引物 5’ GCatgc ATGGATCCTTACAAGTATCGTCCAG 3’ (含有 5^1 位点)；
下游引物 5’ CTCGAG TTAGATGCTTGGTCTCACGTTCAGA 3’ (含有通ol 位点)；上游引物5’端加GCATGC特征序列，并由此形成Sphl酶切位点；下游引物3’末端加ZAoI酶切位点，以拟南芥第一链cDNA为模板扩增，通过PCR扩增得到以堪因的全长cDNA (1479bp)；
(2)回收并纯化全长基因cDNA片段，并将其连接到PMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18T-C^;
(3)构建入门载体pENTR*-PrbcS-*T-^7；用 Sphl 和 ZAoI 酶切 pMD18T-C4辨口pENTR*-PrbcS-*T-GFP，回收以7片段和载体片段pENTR*-PrbcS_*T-，进行连接、转化感受态细胞，得到入门载体pENTR*-PrbcS-*T-C^;
(4)构建植物表达载体pK2-PrbcS-*T-C47；通过Gateway技术的LR反应把克隆到植物表达载体PK2GW7中，获得以堪因的植物表达载体pK 2-PrbcS-*T-^ro
[0009]本发明的植物表达载体对那些能实施转基因操作的植物都适用，如烟草、拟南芥、矮牵牛、非洲菊等。在本发明的实施中以烟草为例说明该表达载体的应用过程。
[0010]1、烟草的转化
采用电转化法转化质粒pK2-PrbcS-*T-U7进入农杆菌感受态细胞，涂布在Spe平板上生长两天后，用菌落PCR检测质粒是否转化到农杆菌中。PCR扩增用以7的上下游引物，扩增片段理论长度为1.5kb，PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，表明质粒已转入农杆菌中。制备烟草、Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，筛选具有卡那霉素(Kan)抗性植株，将其转移到MS培养基(含有3 %蔗糖)上继续培养，从而获得无菌的转基因烟草植株。
[0011]2、6?7?因插入情况的检测
为了检测目的基因以r是否插入有卡那霉素抗性植株烟草的基因组，以抗性苗的基因组为模板，利用以r上下游引物做PCR检测，PCR扩增产物片段理论长度为1.5kb，PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，说明目的基因以7已插入到烟草基因组中。
[0012]3、6?/?因转录水平的检测
为了检测目的基因以7?转基因烟草中是否转录，提取抗性苗RNA，利用以7土下游引物进行RT-PCR检测，RT-PCR扩增片段理论长度为1.5kb，RT-PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，说明目的基因以7已在转基因烟草中正常转录。
[0013]4、以堪因表达后植物过氧化氢酶比活力的检测
为了检测目的基因以靡§码的蛋白在烟草中是否表达、其酶活性是否提高，选取经RT-PCR检测正确的转基因株系的嫩叶，提取总蛋白，测定CAT的比活力，测定结果显示，转基因植物CAT比活力明显高于野生型，说明以7?码的蛋白在烟草中已成功表达，选取I号转基因烟草(Cl)和3号转基因烟草(C3)用于后续气体甲醛处理。
[0014]5、转基因烟草甲醛吸收能力检测
根据酶活测定的水平，选择活性较高的转基因株系进行甲醛吸收能力检测，分别用10 ppm,20 ppm,40 ppm气体HCHO处理野生型烟草(WT)植株和转基因烟草(Cl、C3)植株30min，每5min记录一次甲醛处理装置中剩余HCHO的含量。结果说明，10 ppm、20 ppm、40 ppm处理时，野生型烟草和转基因烟草HCHO吸收能力出现明显差异，且CAT比活力越大其吸收气体甲醛的能力越强，明显可见WT吸收气体甲醛的能力最弱。10 ppm时，Cl吸收的甲醛为85.1%，C3吸收的甲醛为79.9%，WT吸收的甲醛为70% ;三株烟草叶片总面积在0.095-0.105 cm2。转基因烟草甲醛吸收能力明显高于野生型烟草，Cl、C3、WT平均甲醛吸收速率约为 2.84 ppm/m2.min、2.66 ppm/m2.min、2.33 ppm/m2.min。20 ppm 时，Cl 吸收的甲醛为60%，C3吸收的甲醛为51%，WT吸收的甲醛为42% ;三株烟草叶片总面积在0.145-0.155cm2。转基因烟草对气体甲醛的吸收效率仍显著高于野生型烟草，它们的平均甲醛吸收速率约为 2.68 ppm/m2.min、2.27