控制植物分枝的拟南芥基因AtTIE1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种控制植物分枝的拟南芥基因及 该基因的用途。
【背景技术】
[0002] 分枝是植物的重要特性，在很大程度上，分枝影响植物的形态建成。单子叶植物的 分蘖是一种特殊的分枝。在农业生产中，适宜的分蘖数目与粮食作物的高产密切相关。
[0003] 植物的分枝来源于叶腋中的侧芽。尽管侧生分生组织与茎顶端分生组织具有同样 的发育潜力，但是侧芽经常形成具有更少叶片的休眠芽。一旦环境条件适合，休芽便可以被 激活，形成分枝（Journal of experimental botany，2007，vol. 59:67-74)。分枝发育的调 控赋予植物对于持续变化的环境条件的可塑性，这一过程受到严格而精细的调控。
[0004] 分枝的形成过程大致分为两个阶段：腋芽处侧生分生组织的起始和侧芽的发生 (Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003,vol. 100:11765-11770)。侧 芽在什么位置发生以及侧芽是发育成分枝还是处于休眠状态受到多种内源和外源信号的 调控，这些信号从其被感知的部位转导到侧芽（The Plant cell, 2007, vol. 19:458-472)。 在信号转导途径中，植物激素发挥着重要的作用。其中，生长素、细胞分裂素和独脚金内酯 对于调控侧生分生组织的起始和侧枝的发育的作用最为重要。
[0005] 生长素是第一个被报道与分枝调控相关的植物激素。1934年，人们发现植物的顶 端能够抑制侧枝的发生，这种现象称为"顶端优势"。这种现象至少在一定程度上受到生长 素的调控，因为阻止生长素的极性运输或者移除植物的顶端都能促进侧芽的发生，并且这 种促进作用可以被外加的生长素抑制。但是，很多实验证明生长素调控侧枝发育的作用是 间接的。诸多研究表明生长素可能通过下调细胞分裂素的合成、限制细胞分裂素向芽运输 来抑制分枝发育。同时独脚金内酯通过影响主茎中生长素的运输能力来调节侧芽的生长。
[0006] 在侧枝发育的调控中，多个转录因子参与激素的信号转导过程和其他调控过程， 从而行使着重要的功能。拟南芥REV编码一个第三类homeodomain-zip蛋白。它是侧生 分生组织起始所必需的，并且可能在已知的分生组织的调节因子，如SHOOT MERISTEMLESS (STM)和 CLAVATA1 (CLVl)的上游发挥作用（Development, 1995, vol. 121:2723-2735;The Plant Journal, vol. 2001，25:223-236)。LAS是一个GRAS家族的转录调节因子，在营养生 长阶段调控侧生分生组织的起始。las突变体在营养生长时期，叶腋处几乎不能形成侧生 分生组织。LAS可能在REV的上游行使作用（Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, vol. 100:11765-11770)。R2R3MYB 基因编码的 RE⑶LATORS OF AXILLARY MERISTEMS1 (RAXl)，RAX2和RAX3在拟南芥营养生长和生殖生长中均参与调控侧生分生组 织的发育。R2R3MYB基因家族不同成员的突变体控制着不同发育阶段的侧生分生组织的形 成（The Plant Cell，2006，vol.l8:586-597;The Plant Cell, 2006, Vol. 18, 598 - 611)。拟 南芥ROX基因编码一个bHLH家族转录因子，在营养生长早期rox突变体的侧芽形成受到抑 制。ROX在水稻中的同源基因 LAX PANICLE(LAX)和番茄中的同源基因 BAl同样参与侧生 分生组织的形成（The Plant Journal, 2012, vol. 71:61-70)。此外，有研究表明TCP家族 转录因子也参与植物分枝的调控。TBl基因分别在玉米和水稻中负调控侧枝的形成，在其 功能缺失突变体中玉米和水稻的分枝数目显著增加（Genetics，1995, vol. 141:333-346; Th e Plant Journal; 2003, vol. 33:513-520)。BRCl 基因编码一个拟南芥 TCP 家族转录因子， 在侧芽发育过程中发挥重要作用。BRCl的活性与侧芽的产生成负相关关系，并且专一地影 响侧芽的发育。BRCl响应环境和内源的信号，从而控制侧芽发生。生长素和MX途径通过 BRCl 来促进侧芽的休眠 （The Plant Cell, 2007, vol. 19:458-472)。
[0007] 尽管人们已经在植物分枝调控机制的研究中取得了一定进展，但是其调控机制仍 然存在很多没有阐明的问题。本发明研究表明AtTIEl作为一个正调控因子调控拟南芥分 枝发育。这在一定程度上加深了人们对于植物分枝调控机制的理解。在模式植物拟南芥中 深入研究分枝发育的调控机制可能为作物育种提供一定的借鉴。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种控制植物分枝的拟南芥基因及其编码蛋白，用于改良 植物的株型。
[0009] 本发明所提供的影响分枝数目的基因，名称为AtTIEl，来源于拟南芥 (Arabidopsisthaliana),编码下述蛋白质（i)或（ii):
[0010] (i)序列表中的SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的蛋白质；
[0011] (ii)序列表中的SEQ ID No: 1氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失 或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与（i)所述蛋白质相同的功能。序列表 中的SEQ ID No: 1由193个氨基酸残基组成，其N端含有一个核定位信号KRGK (28-31位 氨基酸残基)、一段碱性区域（29-45位氨基酸残基)和一个螺旋结构（47-57位氨基酸残基)， C端末尾含有一个EAR转录抑制基序（188-193位氨基酸残基)。所述取代、缺失或添加的一 至十个氨基酸残基可以是非保守区域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影 响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法，以及对蛋白功能的检测均是本领域技术人 员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋 白并检测其功能。
[0012] 本发明的控制植物分枝的拟南芥基因 AtTIEl的核酸序列可以是其cDNA序列，也 可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90%以上一致性且编码相同功能蛋白的 DNA序列。序列表中SEQ ID N0:2所示的是AtTIEl基因的cDNA序列，SEQ ID N0:3所示的 是AtTIEl基因的基因组DNA序列。
[0013] 本发明还提供了包含上述核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序 列的表达载体。在较佳的实施方案中，所述表达调控序列包括组成型高表达的调控序列，例 如花椰菜花叶病毒35S启动子。
[0014] 本发明的另一目的是提供一种改变植物分枝数目和改造植物株型的方法。
[0015] 应用AtTIEl基因可影响拟南芥等植物的分枝数目，其方法可以是将AtTIEl基 因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述 AtTIE 1基因在植物中表达，得到分枝数目改变的转基因植物。
[0016] 在上述改变植物分枝数目和改造植物株型的方法中，所述AtTIEl基因既可为所 述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90%以上 一致性且编码相同功能蛋白的DNA序列。与所述序列具有90%以上同源性且编码相同功能 蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组DNA序列用已知的方法进行分离和/或修 饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的 微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用（例如，反义或共抑制技 术）中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以 及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。
[0017] 本发明AtTIEl基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器 官。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆 菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如Gateway系列载体(如pB7FWG2 等)、pBin系列载体(如pBinl9等)、pjim系列载体(如pjiml9等)、pCAMBIA系列载体(如 PCAMBIA1301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物 中复制的载体，如pENTR/D-TOPO载体、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。
[0018] 使用本发明AtTIEl基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷 酸前可加上任何一种增强型、组成型或诱导型启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜 花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉米Ubiquitin启动子或水稻actinl启动子等；所述诱导型 启动子可为受低温、干旱、ΑΒΑ、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用 或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用 增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区 域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译 控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可 以来自转录起始区域或结构基因。
[0019] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶（ΝΡΤΠ )基因、 潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素 标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。经上述方法进行筛选后还可采 用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有 目的基因。
[0020] 携带有本发明AtTIEl基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质 体-化学介导法（Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、 微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化 植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可 包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。
[0021] 本发明将编码AtTIEl基因的核酸序列在拟南芥中过量表达，并统计转基因植物 的分枝数目发现，AtTIEl基因具有增加拟南芥分枝数目的功能。因此，本发明所提供的 AtTIEl基因在植物形态建成的优化中有重要的应用价值，利用该基因进行分子育种有望培 育出具有实际生产应用价值的理想株型的植物。
【附图说明】
[0022] 图1显示了实施例3通过实时定量PCR检测TIEl-GFP融合基因在转基因株系3-6 和野生型植株中的表达水平。
[0023] 图2显示了实施例3中TIEl-GFP融合基因过量表达的转基因株系3-6和野生型 具有代表性的植株的分枝表型，图中所示植株均为成熟植株。
[0024] 图3显示