一种提高拟南芥抗虫能力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程与植物品种改良的生物技术领域，具体地涉及一种提高拟南 芥抗虫能力的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，最常用的和研宄最多的抗虫基因是来源于苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis)的Bt基因和来源于植物的蛋白酶抑制剂基因。尽管通过转基 因技术获得异源表达Bt基因或植物蛋白酶抑制剂基因的抗虫植株已取得了显著的成就， 但也带来了很多亟待解决的问题，如害虫对Bt基因产生了抗性，Bt基因的表达产物对植物 产生了有害影响等。精氨酸酶（ARG2)和苏氨酸脱氨酶（TD2)为两个茉莉酸诱导蛋白，这两 个基因受茉莉酸信号途径的激活在叶片中大量表达，ARG2和TD2蛋白则随着昆虫摄食进入 昆虫肠道，在肠道内催化精氨酸和苏氨酸的降解，这样昆虫因缺乏精氨酸和苏氨酸这两个 必需氨基酸而营养不良，发育受阻，最后死亡。而这两个基因在拟南芥中的作用还没有人研 宄。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是通过向拟南芥中转入ARG2和TD2两个基因从而提高拟南芥的抗虫 性，克服现有技术中植物对抗虫基因产生抗性和对植物产生有害影响等问题，提供一种提 高拟南芥抗虫能力的方法。
[0004] 本发明提供的提高拟南芥抗虫能力的方法，包括如下步骤：
[0005] (1)以质粒pBI121LeTD2为模版，利用引物LeTD2_F和LeTD2_R，通过PCR得到目 的片段LeTD2 (1788bp)。将目的片段克隆到带有除草剂抗性筛选标记基因 Bar的安全载体 PBA002 的 AscI 和 XbaI 之间。
[0006] (2)以质粒 pNIGEL07 为模版，利用引物 TUBQ10_F-EcoRI 和 TUBQ10_R-PstI，通过 PCR扩增获得终止子TUBQlO。PCR产物和载体pGreenII0229分别用EcoRI和PstI酶切，凝 胶电泳回收，进行连接，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，然后进行筛选鉴定。阳性克隆送北 京奥科公司进行测序测定，得到正确克隆命名为PG29TUQ10。
[0007] (3)以质粒 pBI 121LeTD2 为模版，利用引物 LeTD2_F-XhoI 和 LeTD2_R，通过 PCR 获 得LeTD2cDNA片段（1788bp)，并将其连入步骤（2)得到的pG29TUQ10的多克隆位点XhoI和 EcoRV之间，转化筛选并经酶切鉴定获得了阳性克隆pLeTD2TU。阳性克隆送去测序，序列测 定结果显示所得到的构建为正确的构建。
[0008] (4)由于没有合适的酶切位点，所以采用同源重组的方法将p35S-LeARG2_T35S片 段克隆到上述步骤（3)构建的pLeTD2TU中。按照ClotieEZS重组克隆试剂盒的说明设计扩 增引物LeARG2-F-SmaI和LeARG2-R-SacI，在上游和下游引物中分别引入载体上插入位点 两侧的15bp序列，利用上述引物，以pB2GW7LeARG2为模版扩增p35S-LeARG2-T35S片段。 用SacI和SmaI双酶切载体pLeTD2TU，使载体线性化。利用CloneEZ重组酶将线性化的载 体pLeTD2TU与PCR扩增好的p35S-LeARG2-T35S进行同源重组反应，然后转化大肠杆菌DH5 感受态细胞。筛选鉴定得到阳性克隆pLeARG2-TD2-TU。阳性克隆送去测序，序列测定结果 显示所得到的构建为正确的构建。质粒pLeARG2-TD2-TU的PCR检测所用引物为35s-F和 LeARG2-574R，扩增出的片段为p35S-LeARG2-T35S上的部分序列。
[0009] (5)以质粒 pNIGEL07 为模版，利用引物 pUBQ10_F-KpnI 和 pUBQ10_R-XhoI，通过 PCR扩增获得启动子pUBQlO。将pUBQlO克隆到步骤（4)得到的pLeARG2-TD2-TU的多克 隆位点KpnI和XhoI之间，得到含有抗虫基因精氨酸酶和苏氨酸脱氨酶的安全转化载体 pLeARG2-TD2,筛选到的克隆经酶切鉴定为阳性克隆。阳性克隆送去测序，序列测定结果显 示所得到的构建为正确的构建。
[0010] (6)将步骤（5)得到的载体与质粒pBA002LeTD2和pB2GW7LeARG2转入农杆菌C 58C1 中，通过花苞浸泡法，将抗虫基因 LeARG2、LeTD2、LeARG2-TD2分别转入野生型拟南芥Col-O 中，获得提高转基因拟南芥抗虫能力的转基因苗。
[0011] 精氨酸酶基因（LeARG2)和苏氨酸脱氨酶基因（LeTD2)是番茄中的两个抗虫基因， 本发明将这两个基因导入拟南芥中得到转基因拟南芥。
[0012] 利用所述转基因拟南芥和对照植物拟南芥的叶片分别饲喂小菜蛾，通过统计小菜 蛾的食叶量、结茧前小菜蛾幼虫的平均质量、小菜蛾的死亡率、小菜蛾的化蛹率及化蛾率检 验转基因拟南芥的抗虫效果。从食叶量来看，这三种转基因拟南芥总体上都与野生型差异 不大；从结茧前小菜蛾幼虫的平均质量来看，ARG2T4-10株系极显著低于野生型；从死亡 率、化蛹率和化蛾率来看，ARG2T4-10(转ARG基因拟南芥的第四代纯合植株）的死亡率显 著高于野生型，ARG2-TD2T4-7 (转ARG2-TD2基因拟南芥的第四代纯合植株）的化蛾率显著 高于野生型，其它株系与野生型相比均无显著差异。由此可见，ARG2T4-10株系抑制了小菜 蛾的生长发育，并较多的杀死小菜蛾幼虫，对小菜蛾具有抗虫性，也就是番茄精氨酸酶编码 基因 LeARG2在拟南芥中的异源表达能够抑制小菜蛾的生长，最终导致小菜蛾死亡。
[0013] 本发明的优点和有益效果：
[0014] 本发明通过将精氨酸酶基因（LeARG2)和苏氨酸脱氨酶基因（LeTD2)遗传转化重 要模式植物拟南芥中以提高其抗虫能力，利用该方法能够显著提高转基因拟南芥对小菜蛾 的抗虫能力，为培育抗虫植物提供了一种十分有效的方法，对降低农药使用、延缓害虫抗性 的产生具有一定的意义，对维持生态系统的平衡和可持续发展也有重大的应用价值。
【附图说明】
[0015] 图I pB2GW7LeARG2的植物表达载体图。
[0016] 图2 pBA002LeTD2的克隆及检验结果。
[0017] 图3 pBA002LeTD2的植物表达载体图。
[0018] 图4 pLeARG2-TD2的克隆及检验结果。
[0019] 图5 pLeARG2-TD2的植物表达载体图。
[0020] 图6转基因拟南芥基因组DNA的PCR检测。
[0021] 图7为转基因拟南芥的RT-PCR检测。
[0022] 图8转基因拟南芥抗虫实验统计。
【具体实施方式】
[0023] 下述结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0024] 本发明所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 实施例1 :转LeARG2、LeTD2和LeARG2_TD2拟南芥的获得
[0027] 1、抗虫基因 LeARG2 (序列1)和LeTD2 (序列2)分别被克隆至载体pB2GW7和 PBI121上。由于pBI121载体的筛选标记是卡纳霉素抗性基因（Nptll)，我们又重新进行了 克隆，将其连接到安全载体PBA002上。同时，我们还将LeARG2和LeTD2构建到同一植物 表达载体pGreenII0229上。如图1为pB2GW7LeARG2的植物表达载体图，该载体启动子为 p35S，载体上自带筛选基因 Bar，我们利用基因工程的方法把LeARG2插入到启动子35S和终 止子35S之间，得到了含有LeARG2的植物表达载体。
[0028] 2、以质粒pBI121LeTD2为模版，利用引物LeTD2_F (序列5)(引入了 XbaI酶切位 点）和LeTD2_R(序列6)(引入了 AscI酶切位点），通过PCR得到目的片段LeTD2 (1788bp)。 将目的片段克隆到带有除草剂抗性筛选标记基因 Bar的安全载体pBA002的AscI和XbaI 之间，转化筛选并经酶切鉴定获得了阳性克隆pBA002LeTD2。阳性克隆送去测序（序列2)， 序列测定结果显示所得到的构建为正确的构建。图2为琼脂糖凝胶电泳得到的的条带，条 带显示该DNA序列大小为1788bp，为正确的LeTD2片段。图3为pBA002LeTD2的植物表达 载体图，该载体分别以P35S和Tnos (序列4)为启动子和终止子，通过在LeTD2片段中加 入Xba和Asc两个限制性酶切位点使其连接到载体pBA002上，得到正确的植物表达载体 pBA002LeTD2。
[0029] 3、我们猜想同时将2个抗虫基因转入大豆基因组中，会增强转基因植株的抗虫 性。所以我们将两个抗虫基因（LeARG2和LeTD2)克隆到同一个植物表达载体上。该构建 共分四步进行。
[0030] (1)将 TUBQlO 连接到载体 pGreenII0229 的 EcoRI 和 PstI 之间
[0031] 以质粒PNIGEL07为模版，利用引物TUBQ10_F-EcoRI (序列7)(引入了 EcoRI限制 性内切酶位点）和TUBQ10_R-PstI (序列8)(引入了 PstI限制性内切酶位点），通过PCR扩 增获得终止子TUBQ10。PCR产物和载体pGreenII0229分别用EcoRI和PstI酶切，凝胶电 泳回收，进行连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，然后进行筛选鉴定。阳性克隆送北京 奥科公司进行测序测定，得到正确克隆命名为PG29TUQ10。
[0032] (2)将 LeTD2 克隆至载体 pG29TUQ10XhoI 和 EcoRV 之间
[0033] 以质粒pBI121LeTD2为模版，利用引物LeTD2_F_XhoI (序列9)(引入了 XhoI酶切 位点）和LeTD2_R，通过PCR获得LeTD2cDNA片段（1788bp)，并将其连入pG29TUQ10的多克 隆位点XhoI和EcoRV之间，转化筛选并经酶切鉴定获得了阳性克隆pLeTD2TU。阳性克隆送 去测序，序列测定结果显示所得到的构建为正确的构建。
[0034] (3)将 P35S-LeARG2-T35S 克隆至 PLeTD2TUSacI 和 SmaI 之间
[0035] 由于没有合适的酶切位点，所以采用同源重组的方法将p35S-LeARG2-T35S片 段克隆到上述构建pLeTD2TU中。按照CIoik'EZ κ重组克隆试剂盒的说明设计扩增引物 LeARG2-F-SmaI (序列 10)和 LeARG2-R-SacI (序列 11)。利用上述引物，以 pB2GW7LeARG2 为 模版扩增p35S-LeARG2-T35S片段。用SacI和SmaI双酶切载体pLeTD2TU，使其线性化。利 用CloneEZ重组酶将线性化的载体pLeTD2TU与PCR扩增好的p35S-LeARG2-T35S进行同源 重组反应，然后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。筛选鉴定得到阳性克隆pLeARG2-TD2-TU。 如图4为pLeARG2-TD2的酶切检测结果，M为Lambda DNA PstI marker 24,1为质粒 pLeARG2-TD2, 2-3 为 pLeARG2-TD2 的 XbaI 酶切检测结果，4-5 为 pLeARG2-TD2 的 EcoRI 酶