专利名称：拟南芥中的质体转化的制作方法
按照35U.S.C.202(c)节的规定，美国政府拥有本项发明的某些权利，本发明的部分资金来源于美国科学基金准许MCB93-05037号。发明领域本发明涉及转基因植物领域。具体地说，本发明提供十字花科植物中质体转化的组合物和方法。发明背景为了更全面第描述与本发明相关的技术状况，在本项申请的括号内引用了一些文献。这些参考文献的完整引述列于本说明书结尾处。这些文献的公开内容在本说明书中均如全文般被引作参考。
高等植物的质体基因组是大小为120-160kb的环状双链DNA分子，在每个叶片细胞中可能有出现1,900-5,000个这样的考贝(Palmer,1991；Bendich,1987)。通过下列步骤已获得了烟草质体基因组(plastome)的稳定转化(ⅰ)通过生物发射(biolistic)方法(Svab等，1990 a；Svab和Maliga 1993)或PEG处理(Golds等，1993；O’Neill等，1993)导入编码抗生素抗性的转化DNA，(ⅱ)通过两次同源重组事件使转化DNA整合，(ⅲ)在重复的细胞分裂期间在选择培养基上选择性地消除野生型基因组考贝。壮观霉素抗性曾被用作或是突变质体中16S核糖体RNA基因中编码的(Svab等，1990a；Staub和Maliga1992；Golds等，1993)，或是通过工程化细菌的aadA基因的表达被赋予的(Svab和Maliga1993)选择性标记。利用aadA作为选择标记基因并将嵌合基因的插入定位于烟草质体基因组重复区域的载体现已可得到(Zoubenko等，1994)。在新霉素码磷酸转移酶表达的基础(kan基因)卡那霉素抗性选择质体转化体则更困难，但也是可行的(Carrer等，1993；Carrer和Maliga,1995)。
迄今为止，高等植物的稳定质体转化仅在烟草中有所报道(Maliga,1993；Maliga等，1993)。非常需要获自其它具有农业和药用重要性的物种的转质体基因(transplastomic)组植物。外源目的基因在十字花科高等植物质体中的表达比外源基因的核表达更具一些优势。即1)外源DNA序列在质体中的表达消除了转化DNA经花粉传递的可能性；2)可获得高水平的蛋白质表达；3)多个基因作为多顺反子单位的同时表达是可行的；以及4)核转化后可能导致的位置效应和基因沉默也被排除了。发明概述本发明提供产生稳定转化的转质体基因组植物的改良方法。在本发明的一个实施方案中，将子叶细胞在高植物生长激素的液体培养基中充分培养一段时间以刺激均一的细胞分裂。开始是进行高密度培养(50-200个子叶/20ml)。然后将所述子叶转至用琼脂固化的培养基上进行外源基因(即转化DNA)的传递。传递转化DNA之后，将子叶以较低密度(20-30/50ml)转至含有高浓度水平细胞激动素和筛选剂的培养基中以利于转化体的筛选和植株再生。随后通过Southem印迹分析或PCR法确认质体基因组中是否存在所述外源DNA。
本发明的转化DNA分子具有一些特殊的特征。它们是1)邻接外源目的基因的寻靶区段由来自待转化植物的质体DNA序列组成，从而有助于该转化DNA同源重组入质体基因组的预定区域；2)该寻靶区段中放置的选择性标记基因，可对筛选剂赋予抗性；3)质体DNA来源的5’端和3’端调控序列，它与编码外源目的基因的序列相连，从而增强了转化DNA的表达和所编码mRNA的稳定性；以及4)与选择性标记基因相邻的至少一个克隆位点，用于插入自身不具选择性的外源目的基因。由于该选择性标记基因和该外源目的基因形成了一段相邻的异源序列，可实现两个基因在质体基因组中的整合。
在本发明的另一个实施方案中，首先用含高植物生长激素的培养基处理叶片细胞，然后用转化DNA进行转化并在有高浓度水平细胞激动素和预定筛选剂的存在下进行培养。将含有转化质体的细胞在筛选剂存在下保持，以利于获得能够再生成为转质体基因组植株的同质性细胞。
因此，本项发明提供了产生转质体基因组植物的新方法和组合物。拟南芥属属于分布范围广，约含340个属和3350种的芸苔科或十字花科(Brassicaceae或Cruciferae)。该科植物作为蔬菜作物资源，油料种子，香料以及较小程度的装饰品，具有重要的经济价值。它的大部分农业重要性来自芸苔属，芸苔属种的经济价值举例有甘蓝型油菜(含油种子)、芥菜(含油种子)、油菜(含油种子)、甘蓝(茎花椰菜、花椰菜、卷心菜)、黑芸苔(黑芥)以及Brassica hirta(白芥)。
在此例举在植物研究模型种(Meyerowitz和Sommerviue,1994)和重要的农作物芸苔属种拟南芥中进行的质体转化。这些方法适用于十字花科其它植物的质体转化。附图简述
图1图释用质粒pGS31A进行转化后aad A在该拟南芥属质体基因组(ptDNA)的整合。图1A显示转化载体pGS31A的图谱，ptDNA区含有整合的壮观霉素抗性(aad A)基因(T-ptDNA)和野生型ptDNA的同族区。16SrDNA、rps12/7和trnV是质体基因(Shinozaki等，1986)。图1B表明包含于P1探针和P2探针中的ptDNA区。图1C是表明Southern印迹杂交结果的放射自显影图，它确认了aadA在质体基因组中的整合。P1寻靶序列与野生型(At)植物中的2.72-kb片段和该转质体基因组系(At-pGS31A-16)中较大的3.82-kb片段杂交。请注意转质体基因组系中缺乏野生型片段。aadA探针P2只与较大的转质体基因组片段杂交。
图2图释在拟南芥属叶片中所运用的质体转化方案。
图3图释从含有转化质体的拟南芥(RLD)子叶外植体获得可育拟南芥属植株所采用的不同方案。
图4是质粒pGS7和质粒pGS85A的质体寻靶区图谱。请注意质粒pGS7中单一的HincⅡ克隆位点和质粒pGS85中的KpnⅠ限制性酶切位点，以及嵌合的kan卡那霉素抗性基因。质体基因trnV、16SrDNA和rps12/7在Shinozaki等，1986中有所描述。转录起始位点和方向以水平箭头表示。
图5是质粒pGS7寻靶区的序列。赋予卡那霉素或壮观霉素抗性的基因将被插入标明HincⅡ的位点。
图6是质粒pGS31A的质体寻靶区序列。
图7是质粒pGS85A的质体寻靶区序列。发明详述就人们所知，质体转化仅在烟草中有所证明。拟南芥和甘蓝型油菜中质体的转化方案现已形成，并将用来产生这些转化体的方法列于以下。在以下实施例中运用拟南芥属和芸苔属是为了描述本发明方法。在此公开的方法可适用于十字花科的其它植物。
如以下实施例Ⅰ中的描述，已经按照用生物发射法将显微(1μm)钨粒表面的转化DNA传递到叶片细胞，转化了拟南芥的质体。用于这些实验中的转化质粒pGS31A携带侧翼为质体DNA序列的壮观霉素抗性基因(aadA)基因，所述质体DNA序列可将其插入靶定于trnV和rps12/7操纵子之间。通过侧翼ptDNA序列发生两次同源重组事件后的aadA整合以及在壮观霉素培养基上转质体基因组体的筛选扩增，产生了壮观霉素抗性细胞系。再生植株是同质的，因为质体基因组考贝已由转化DNA完全改变。质体转化效率很低，201个受轰击的叶片样品中只有两个被转化。然而，从两个转化系再生的98株植物均不育。
这些育性问题似乎要归因于长期用2,4-D(一种植物生长激素)处理(Van der Graff和Hooykas,1996)。缩短在这种试剂中的暴露时间有可能克服育性问题。拟南芥相对较长的生长周期为转化提供了适合的叶片资源，但同时也使叶片成为较不理想的组织来源。
子叶和叶片的每个细胞中均含有丰富的质体基因组考贝。另外，子叶提供了更方便的组织来源。因此，如在以下的实施例Ⅱ中所述子叶细胞已被用作转化DNA的受体。子叶细胞优于叶片细胞进行本发明方法的实践，是由于制备用作转化DNA轰击细胞的培养周期相对短(7天)。将子叶细胞作为靶细胞的其它优点据报道是在没有2,4-D存在时可由未成熟子叶再生可育的拟南芥属植株(Patten和Meinke,1988)。另外，也已经描述了也在缺少2,4-D的情况下从叶片外植体再生可育拟南芥属植株的方案(Lloyd等，1986；Van der Graaff和Hooykas,1996)。
如实施例Ⅲ中所描述，拟南芥和甘蓝型油菜同属一个科-十字花科，质体因而享有高度的同源性且基本相同(Palmer等，1994)。据此，开发用于拟南芥属的质体转化载体和表达盒可以不加修改而用于芸苔属种的质体转化和外源基因的表达。
提供以下定义以利于本发明的理解异质(heteroplasmic)指在单个质体中或在植物细胞或组织中含有的质体群体中存在不同质体基因组的混合群体。
同质(homoplasmic)指在质体中或在植物细胞和组织中含有的质体群体中纯群体的质体基因组。同质的质体、细胞或组织由于仅包含一种类型的质体基因组，它们在遗传上是稳定的。因此，即使撤除选择压力之后它们仍保持同质性，并且自交后代也是同质性。为了本发明的目的，功能性同质的基因组异质群体(例如，仅包含少量野生型DNA或有序列变异的转化基因组的群体)可在此被称为“功能性同质”或“大致同质”。这些类型的细胞或组织可通过在非致死性选择培养基上连续筛选而轻易地纯化成同质性(homoplasmy)。由于质体基因组的随机筛分，大多数这种植物的种子后代在缺少选择压力时是同质的。
质体基因组(plastome)质体的基因组。
转质体基因组(transplastome)经转化的质体基因组。
质体的转化转化DNA在质体基因组中稳定整合并将之传播到含转化质体的植物种子后代。
选择性标记名词“选择性标记”指当一个编码该选择性标记的基因或等位基因被包括在用于转化的外源DNA中时，鉴别成功转化的器官、细胞或组织的表现型。
转化DNA指同源DNA或以同源DNA为侧翼的异源DNA，当被导入质体后可通过同源重组置换部分质体基因组。
寻靶区段指有助于外源DNA和质体基因组之间同源重组的那些同源侧翼区。
转录性融合指构建物(construct)中来源不同的两个编码DNA区段在构建物中剪接在一起，使得表达嵌合蛋白。
高植物生长激素培养基仅含植物生长激素或含高浓度植物生长激素和很低浓度细胞激动素组合物的植物组织培养基。植物细胞对细胞生长素的反应对于特定的分类组别是特异性的。当联合应用不同的植物生长激素时，它们的效应可能不会叠加。另外，组织对于植物生长激素的反应可通过细胞激动素而改变。据此，所使用的植物生长激素类型和浓度应凭对所转化物种的经验而决定。本发明中所用的高植物生长激素培养基的优选例子是Cl培养基，它含有1mg/ml的植物生长激素1-萘乙酸(NAA)和低浓度(0.2mg/ml)的细胞激素素6苄氨基嘌呤(BAP)。其它植物生长激素，如吲哚-3-乙酸(2AA)和二氯-苯氧基乙酸(2,4-D)也可用于刺激均一的细胞分裂。
高细胞激动素培养基与高植物生长激素培养基一样，植物细胞对高细胞激动素培养基的反应具分类组别专一性。本发明中应用的高细胞激素素培养基的优选例子是C培养基，它含有1mg/L BAP、2mg/LZip、(6-(γ,γ-二甲基烯丙氨基)嘌呤或IPA、N6-(异戊烯基)腺嘌呤)以及低浓度植物生长激素NAA (0.1mg/L)。其它可采用的细胞激素有6-糠氨基嘌呤(KIN或激动素)。
以下实施例中所提供的详细描述涉及制备和使用本发明DNA构建物以及实施本发明方法的优选方法。任何未作具体描述的分子克隆和重组DNA技术均依照标准方法进行，这些方法一般例如在Sambrook等的“DNA克隆，实验室手册”(冷泉巷实验室，1989)或Ausubel等编辑的“分子生物学现行方法”(John Wiley和Sons,1995)中提出。
提供以下实施例对本发明进行更充分的描述。它们的目的并不在于以任何方式限制本发明范围。
实施例Ⅰ以壮观霉素抗性为选择的拟南芥属叶片的质体转化以下材料和方案使实施例Ⅰ方法的实施成为可能。图2提供了所用方法的示意图。植物材料作为转化受体，采用拟南芥属生态型RLD。据报道该生态型在培养中易于再生(Marton和Browse,1991)。载体pGS31A的构建拟南芥属质体转化载体pGS31A示于图1。pGS31A的直接前身是噬菌粒载体(Stratagene)pBluescnpt KS(+)的衍生物质粒pGS7。质粒pGS7载有包含16SrRNA基因5’-端、trnV和部分rps12/7操纵子的拟南芥属ptDNA的2-kb Hind Ⅲ-EcoRⅠ片段。在质粒pGS7的构建过程中，用HindⅢ(位于16SrDNA中)和KpnⅠ(在载体中，用T4 DNA聚合酶处理以除去单链突出部分)进行消化，并连接所述平端，除去了HindⅢ位点。载体pGS31A载有存在于质粒pZS197的选择性壮观霉素抗性基因(Prrn::aadA::TpsbA)(Svab和Maliga,1993)。aadA编码区转录自含有融合了合成核糖体结合位点(Prrn)的烟草rRNA操纵子的启动子的合成型启动子。通过将该编码区的下游序列与烟草质体psbA基因(TpsbA)的3’非翻译区转录性融合，使aadA mRNA稳定。pGS31A中的基因来源于修饰后的pZS197前身，其中位于aadA和TpsbA之间的XbaⅠ位点已通过钝化而除去)。通过用Ecl136Ⅱ(SacⅠ的一种同裂酶(isochisomer)，产生平端)和BspHI(填补单链突出部分以获得平末端)切割aadA嵌合基因，以连接入质粒pGS7中位于trnV和rps12/7操纵子之间唯一的HincⅡ位点，得到质粒pGS31A。组培培养基采用Marton和Browse(1991)及Czako等(1993)的组培方案。拟南芥属组培培养基(ARM)来源于Murashigl和Skoog(1962)的MS培养基。ARM培养基为MS盐、3％蔗糖、0.8％TC琼脂、2ml/L维生素溶液(每毫升含100mg肌醇、5mg维生素B1、0.5mg维生素B6、0.5mg尼克酸、1mg甘氨酸及0.05mg生物素)。ARMⅠ培养基为每升含有3mg吲哚乙酸(IAA)、0.15mg 2,4-二氯-苯氧乙酸(2,4-D)、0.6mg苄基腺嘌呤(BA)和0.3mgLPA的ARM培养基。ARMⅡr培养基为补充有0.2mg/L萘乙酸(NAA)和0.4mg/L IPA的ARM培养基。拟南芥属苗诱导(ASI-N1B1)培养基为补充有1mg/L NAA和1mg/L BAP的ARM培养基。拟南芥属幼苗在ARM培养基上生根。拟南芥属种子培养基(ARM5)为补充有5％蔗糖的ARM培养基。将植物激素贮液过滤除菌，并在高压灭菌后冷却至45℃时加进去。
选择培养基含有500mg/L盐酸壮观霉素和/或硫酸壮观霉素。培养基高压灭菌后冷却至45℃时加入抗生素(先过滤除菌)。拟南芥属植株的无菌培养在Eppendorf管中用1ml商用漂白剂(5.25％次氯酸钠)处理种子(25mg)5-7分钟并不时地旋涡混合以进行表面消毒。将种子连同漂白剂倒入一个含有10ml90％乙醇的圆锥形离心管中温育5-7分钟。弃去乙醇-漂白剂混合物，用10ml高压灭菌的去离子水漂洗种子4次并最后将其悬浮于无菌水中(约150种子/ml)。将得到的种子悬液倒入含50mlARM5培养基的10cm深(10mm高)培养皿中。搅动悬浮液使种子均匀分散开。然后用移液管从平板中吸去水分。于24℃培育10-15天后种子萌发，在此期间用冷白荧光管(2000lux)光照所述平板8小时。
为使具较大幼叶的植株生长，将幼苗单独转至ARM5平板中(每10cm培养皿中10棵)并用冷白荧光灯泡(lux；白天21℃，夜间18℃)光照8小时。5-6周后摘取1cm至2cm大小的深绿色较厚叶片进行轰击。壮观霉素抗性系的转化和筛选从无菌生长的植株采摘用于质体转化的叶片(长约1.5mm至30mm)。将12至18片叶子置于用琼脂固化的ARMⅠ培养基上，以覆盖直径为4-5cm的圆形面积。通过生物发射过程，用氦气驱动的PDS1000型生物发射枪将显微(1μm)钨粒表面上的pGS31A载体DNA导入叶片叶绿体中。在450psi下轰击新鲜叶片(靶目标置于距破裂圆盘(rupture disk)9cm；生物发射枪中顶端的第3号位置处)。在ARMⅠ培养基上培养4天之后的叶片轰击力为1100psi(靶目标置于距破裂圆盘12cm；生物发射枪顶端的第4号位置处)。
在ARMⅠ培养基中进行叶片轰击。轰击之后，叶片在ARMⅠ培养基中再培育两天。培育期之后，用一叠刀片挤压叶片以产生一系列间隔为1mm的平行切痕。先前已经观察到机械创伤对于在叶片中诱导均一愈伤组织的形成很重要。将压痕后的叶片转至含壮观霉素(500mg／ml)的相同培养基(ARMⅠ)中，以利于含有ptDNA转化考贝的质体优先复制。ARMⅠ培养基诱导叶片细胞的分裂和无色的胚性愈伤组织的形成。在ARM2培养基上筛选7-10天后，在通常诱导绿化的ARMⅡr培养基上继续进行壮观霉素筛选。由于壮观霉素阻止野生型细胞变绿，只有壮观霉素抗性细胞形成绿色愈伤组织。21至70天之内在选择性ARMⅡr培养基上出现肉眼可见的绿色细胞团。
在轰击的201个样品中获得19个壮观霉素抗性系。在14个壮观霉素抗性系中尝试植株再生，其中10个系获成功。由绿色愈伤组织形成的苗在ASI-NIBI培养基上再生，并在ARM培养基上生根。
表1陈述经发物发射法转移质粒pGS31A之后壮观霉素抗性细胞系的回收表1用质粒pGS31A轰击拟南芥之后壮观霉素抗性系的回收
1所述对照平板未轰击。2psi=磅/每平方英寸，圆盘裂缝的值。为确认质体转化而进行的细胞总DNA Southem杂交分析壮观霉素抗性可归因于质体中aadA的表达(Svab和Maliga,1993)，核中aadA的表达(Svab等，1990b)或自发突变(Foromm等，1987；Svab和Maliga,1991)。进行Southern印迹杂交以鉴定分离的壮观霉素抗性系中的质体转化。按Mettler(1987)法分离细胞总DNA。经限制性内切酶消化后的DNA在0.7％琼脂糖凝胶上电泳并用PosiBlot转移装置(Stratagene)转至尼龙膜(Amersham)上。用具有随机引物法(Boehringer-Mannheim)制备的32P标记探针的快速杂交缓冲液(Amersham)探测印迹。用靶ptDNA作探针时，在At-pGS31A-2系和At-pGS31A-16系中仅探测到3.82kb的转基因片段，这表明在选择培养基上的细胞分裂过程中野生型ptDNA考贝已被选择性地稀释掉了。相同的转基因片段也与aadA探针杂交(图1C)。
与寻靶ptDNA探针杂交时，在Souther印迹上用一个野生型片段从19个壮观霉素抗性系中鉴定出17个核转化体。请注意所运用的Southem印迹最适于高考贝(每个细胞中1000个)叶片ptDNA，并且在有少量核aadA考贝时不会显示信号。
预期自发突变株在Southern印迹中有野生型ptDNA寻靶片段且无PCR可扩增的aadA基因。在19个壮观霉素抗性系样品中，未发现这样的自发突变。aadA插入序列的PCR扩增按标准方案扩增DNA(92℃1分钟，58℃1.5分钟、72℃1.5分钟30个循环)。使用以下引物通过一个407个核苷酸的内部片段的PCR扩增，可以证实作为aadA表达结果的壮观霉素抗性5′-GCTTGATGAAACAACGCGG-3′5′-CCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAG-3′转质体基因组的拟南芥属植株当转质体基因组的拟南芥属植株全部开花后，没有一株在自花授粉后，或用野生型植株的花粉传粉后结籽。这其中包括从因质体转化而显示壮观霉素抗性的两个系再生的98棵植株、以及从因aadA在核基因组中表达而显示壮观霉素抗性的12个系再生的66棵植株。结论和含义本发明描述了一个重要的农业上的突破-在模式种拟南芥中进行的质体转化。在以前研究结果的基础上，发现嵌合aadA基因插入拟南芥属ptDNA寻靶盒时，适用于在转化DNA的生物发射转移后回收质体转化体。但是，拟南芥属质体转化体数目比基于烟草质体转化(每个轰击样品平均产生一个转化体)(Svab和Maliga,1993；Zoubeako等，1994)的预期值要低得多，100个中约一个。转化率相对低的原因也许有多种。内在的种特异性差异，如拟南芥属叶绿体中同源重组系统的相对效能差可能是一个明显的原因。
在烟草载体pZS197中，aadA的侧翼是1.56-kb和1.29-kb的ptDNA，每次轰击产生大约1个转化体(Svab等，1993)，在烟草的另一个载体质粒pRB15中，aadA的侧翼是1.56-1b和3.6-kb ptDNA的较大寻靶区段，每次轰击产生大约5个质体转化体(Back和Maliga,1995)。在拟南芥属载体pGS31A中，aadA两侧仅有约1-kb大小的质体寻靶序列。所以，拟南芥属中质体转化效率也许可以通过增大靶ptDNA片段而明显提高。
与大多数从叶片再生的植株具可育性的烟草相反，可惊奇地发现164棵再生的拟南芥属植株均未结籽。缺乏育性部分应归因于如Galbright等(1991)和Melaragno等(1993)所报道的叶片组织的广泛多倍性。缺乏育性的另一个原因可能是该培养物长时间暴露于2,4-D(vander Graff和Hoog Kaas,1996)。
实施例Ⅱ以卡那霉素抗性为选择的拟南芥属子叶的质体转化如实施例Ⅰ中所述，用DNA包裹的钨粒轰击后，通过在叶片培养物中选择壮观霉素抗性，已经获得拟南芥的质体转化。虽然质体转化是成功的，但再生植株不育。这些障碍已通过改变转化方案的某些参数而克服。
该实施例中开发和陈述的方案具有以下显著特征(1)通过萌发成熟种子获得的子叶由于其易得性以及从表面消毒种子获得大量无菌子叶的简易性，使用它是有利的。(2)该方案有两个独特步骤。使用高植物生长激素培养基以诱导整个子叶均匀的细胞分裂(阶段Ⅰ)，的第一个步骤和用高细胞激动素培养基诱导植株再生(阶段Ⅱ和阶段Ⅲ)的第二个步骤。将该方案设计成或者减小组织培养中对含2,4-D培养基的暴露，或者更优选完全消除这样的暴露。(3)所述子叶细胞最初是高密度培养，例如，最初8天(阶段Ⅰ，阶段Ⅱ)在液体培养基中密度为500-200个子叶/20ml，证明对于以后获得大量的植株再生是必要的。
如下进行将子叶用作靶组织并将卡那霉素抗性作为选择标记的拟南芥属质体转化方案。嵌合kan基因来源于编码新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)的pUC118的衍生物质粒pTNH7,NPTⅡ是一种可灭活抗生素卡那霉素的酶。用与烟草寻靶质粒(质粒pTNH32)中相同的嵌合kan基因直接选择烟草中的质体转化体(Carrer等，1993)。在同一参考文献中有关于kan基因构建的更详尽描述。通过从pTNH7中切下作为SacI/PstⅠ片段的kan，将其钝化并将该片段克隆进质粒pGS7的HincⅡ位点而获得质粒pGS85A(图4)。将PG85A中的kan基因如质粒pGS31A中的aadA般，在Prrn/TpsbA盒中表达。然而，将高表达rbcL编码区的N-端5个氨基酸与该新霉素磷酸转移酶的N-末端翻译性融合。与无rbcl N-末端区段的相同构建物相比，烟草中的这种翻译性融合导致NPTⅡ以高10X的水平积累。本文陈述了pGS85A的DNA序列，包括嵌合kan基因的DNA序列。
首先，在通过组织培养方案再生的植株中检测结籽情况。接着平均用包裹DNA的钨粒轰击后卡那霉素抗性克隆的筛选。这些方法上的改进对于产生可育转化拟南芥属植株性是适当的。以下材料和方案被用于进行该实施例Ⅱ方法的实施。种子萌发用商用漂白剂(5％次氯酸钠)对拟南芥生态型RLD的种子表面消毒5分钟，接着用95％乙醇处理5分钟。在消毒过程中加一滴TritonX-100于漂白剂中以湿润种子表面。消毒之后，用无菌去离子水漂洗种子5-6次。在10cm培养皿中的GM培养基上萌发种子。见表2。将培养皿置于23℃连续光照的Perciual生长箱中培育8-9天。表2．种子萌发(GM)培养基的组成培养基浓度(mg/L)MS基本盐分0.5X肌醇 100硫胺 0.1吡哆醇0.5尼克酸0.5甘氨酸2.0蔗糖 30g/LpH5.8参考Van der Gradff和Hooykaas,1996。组培培养基和培养条件用于选择方案阶段Ⅰ，阶段Ⅱ和阶段Ⅲ的组培培养基组成列于表2和表3。阶段Ⅰ和阶段Ⅱ的液体培养物通过将至少50至2000个子叶无菌转移至每皿含大约20ml培养基的培养皿(100mm×20mm)中建立起来。将培养皿置于一个New Brunswick G10旋转式摇床上于23℃以60rpm进行培育并用冷荧光光照16小时。在阶段Ⅲ的流程中，将子叶置于以琼脂固化(0.8％TC琼脂，JRH Biosciences)的培养基上以每培养皿(100mm×20mm)中50ml培养基约有25-30个子叶的方式进行培育。如阶段Ⅰ和阶段Ⅰ所述的方法光照培养物。
将再生植株直接转至具通气盖子以便气体交换的Mageata盒子中的GM培养基。Magenta盒子中的植株在23℃的培养室中，且用冷荧光光照16小时进行培育。植株在盒子中开花并结籽。
将实施Ⅰ所描述的方法修改后用于产生具有转化质体基组的可育拟南芥属植株。采用三个不同的组织培养阶段可获得质体的转化。阶段Ⅰ在高植物生长激素培养基中刺激均一的细胞分裂的液体培养。阶段Ⅱ在高细胞激动素培养基中从转化细胞诱导植株再生的液体培养。阶段Ⅲ在含高水平细胞激动素的琼脂固化培养基上也诱导植株再生的培养。
用于鉴定获得可育质体转化体的最佳方案的示意图概括于图3中。为了诱导液体培养中均一的细胞分裂，运用了Cl(van der Graafft和Hoogaas,1996)、ARMⅠ(Marton和Browse,1991)、R3和PG1(Feldmann和Marks,1986)据报道在拟南芥属中诱导愈伤组织和/或体细胞胚胎发生)四种培养基。保持短时间(2天)的阶段Ⅰ处理可适应轰击后外植体转至选择培养基的通常计时，真要使用2,4-D时，可减小其副反应。阶段Ⅰ所用组织培养基的组成列于下列表3中。表3阶段Ⅰ组培培养基的组成培养基ARMⅠ C1R3PG1基本盐分 MsMsMsMs维生素ARMⅠ B5MsB52,4-D 0.15-0.5 2.2BAP 0.60.2- -IAA 3.0 -5.0-IPA 0.3 - - -NAA- 1.0- -KIN- -0.3 0.05蔗糖 30g30g 30g 30gpH5.85.8 5.8 5.8*所有组分均以mg/L计。参考文献ARM1,Marton和Browse,1991；C1,van der Graaff和Hooykaas,1996；R3和PG1,Fledmann和Marks(1986)阶段Ⅱ的培养仅用了一种培养基(A；表4)。这种培养基对于从未成熟子叶诱导植株再生是有效的(Patton和Meinke,1988)。在液体培养中再以高密度保持阶段Ⅱ的子叶共6天。
为进行阶段Ⅲ的培养，将子叶转至四种琼脂固化型再生培养基中。这些包括开发供未成熟胚再生植株的A培养基(Patton和Meinke,1988)；开发供根外植株再生植株的B培养基(ARMⅡ；Marton和Browse,1991)；在此设计的C培养基；以及进行根胚诱导(ARMⅠ,Marton和Browse,1991)和叶片外植体胚诱导(实施例Ⅰ)的D培养基。表4阶段Ⅱ和阶段Ⅲ的植株再生培养基培养基A培养基*B培养基*C培养基*D培养基*基本盐分Ms Ms Ms Ms维生素 B5 B5 B5 B5NAA 0.1 - 0.1 -IAA - 0.1-3.0BAP 1.0 - 1.0 0.62iP - 4.02.0 0.32,4-D- - -0.15蔗糖30g 30g30g 30g琼脂(TC)7g 7g 7g 7gpH 5.8 5.85.8 5.8*所有组分均以mg/L计。A培养基基于Patton和Meinke,1988；B培养基与Marton和Browse(1991)中的ARMⅡ相同；本文开发的C培养基基于A和D培养基；D培养基与Marton和Browse(1991)中的ARMⅠ诱导培养基相同。植株再生和育性检测在阶段Ⅰ培养的头两天里四种培养基中的子叶均保持绿色并微微膨大。在愈伤/胚诱导培养基中两天之后，将阶段Ⅱ的子叶从全部的四种培养基中转至A液体再生培养基。在A培养基培养3天后开始出现绿色愈伤组织并且至第7天为止所有子叶均出现愈伤组织。在此阶段将培养转至可促进胚/苗生长的阶段Ⅲ半固体培养基中。得自培养基1(ARM1)和培养基2(C1)的愈伤组织是绿色的。培养21天后可观察到从这些外植体发育的小植株。得自培育基3(R3)和培养基4(PG1)的愈伤组织也是绿色的，但很致密。这大概要归因于阶段Ⅰ培养基中高浓度的2,4-D。30天以后在这些培养物中出现一些小植株。将来自所有培养物的植株当其大小达到5-10mm时就转入无激素的GM培养基。
图3所绘的方案可作以下两个水平的评价子叶细胞分裂的均一诱导和苗再生，以及再生植株上可见种子的产生。结果总结于表5。基于第一个标准，最佳组合是2AC，即阶段Ⅰ是C1培养基，而阶段Ⅲ是C培养基，这些处理导致在每个外植体上可观察到的大量苗再生。第二个最佳组合是1AC(40个外植株中的35个再生出苗)，即阶段Ⅰ用ARM1而在阶段Ⅲ用培养基C。在阶段Ⅰ培养基3和培养基4组合表现非常差，仅很小的一部分子叶形成苗。
至于可见种子的形成，除一例外每个再生植株均产生了可见种子。见表5。最重要的是，在有大量苗再生的两种组合(2AC和1AC)中未发现育性方面的负效应。
表5在Magenta盒子中通过图3图示的质体转化方案再生的拟南芥RLD植株的结籽情况。
培养基培养的生苗的盒中的具有可见子叶数子叶数植株数种子数1AA40208 81AB40258 81AC40358 81AD40 -- -2AA402512122AB40228 72AC404016162AD402 - -3AA40124 43AB406 4 43AC4020- -3AD401 - -4AA401 - -4AB401 - -4AC404 4 44AD401 - 1用卡那霉素抗性筛选质体转化体被导入拟南芥属核中时，编码新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)的kan的表达可赋予对卡那霉素的抗性。在拟南芥属中，见Valvekens等，1988和芸苔属中，见Radke等，1992，已广泛使用工程化形式的kan以获得核转化体。在烟草中已将kan基因转变成进行质体转化体筛选的质体标记(Carrer等，1993)。如实施例Ⅰ中所述，通过烟草Prrn/TpsbA盒中aadA赋予的壮观霉素抗性筛选已获得了拟南芥属质体转化体。Prrn是来自质体rRNA操纵子的启动子，而TpsbA含有稳定嵌合质体mPNA所需的质体psbA基因的3’非翻译区(Svab和Maliga,1993)。通过在Prrn/TpsbA盒中表达kan可获得适合质体转化体筛选的卡那霉素抗性标记基因。来自拟南芥属和芸苔属的适合的卡那霉素抗性质体转化载体是载有质体pTNH32中嵌合卡那霉素基因的pGS85A载体(Carrer等，1993)。pGS85A中的插入位点是trnV/vps12/7内部的HincⅡ位点。然而，质体基因组中的其它基因间隔区可作为提供导入的转基因的靶，而不干扰侧翼质体基因的表达。
可按以上概述的1AC或2AC组织培养方案进行质体转化。为准备转化所用的适合靶组织，从液体ARMⅠ和CI培养基中8-9天龄的幼苗上切下子叶，并如1AC和2AC方案(图3)所述培养两天。两天后将子叶转至相同组成的经琼脂固化的非选择性培养基上的滤纸(Whatman4号)上。大约需要50至70个子叶以覆盖3cm2的面积。然后用具卡那霉素抗性的拟南芥属转化载体质粒pGS85A)轰击子叶。质粒的制备、钨粒的包被和轰击应按对烟草的描述方法(Maliga,1995)进行。对于表型表达，可将子叶置于相同平板中2天。然后，可将子叶转至含50mg/L硫酸卡那霉素的选择性液态培养基A中再培养7天。7天后，将子叶转至含50mg/c卡那霉素的选择性琼脂固化培养基C。在另一个实施中，可首先用25mg/ml卡那霉素进行筛选。在培养后期，将卡那霉素浓度升至50mg/ml。可早在一周时观察到在选择培养基中由转化细胞生成愈伤组织。但是，其它卡那霉素抗性克隆可能在数周后出现。其中一些是质体转化体，而获得卡那霉素抗性的其它一些克隆则应归因于核中质体kan基因的表达(Carren等，1993)。可通过DNA凝胶印迹分析和PCR分析(如实施例Ⅰ所述)轻易地分辩出这两种类型的卡那霉素抗性克隆。按标准方案扩增DNA(92℃1分钟，58℃1.5中，72℃1.5分钟，30个循环)。卡那霉素抗性是由于新霉素磷酸转移酶基因表达而发生的，这可通过使用以下引物PCR扩增548个内部核苷酸片段的得到证实5′-CCGACCTGTCCGGTGCCC-3′5′-CACGACGAGATCCTCGCCG-3′.
实施例Ⅲ以壮观霉素抗性和卡那霉素抗性为选择的甘蓝型油菜中叶片的质体转化已知拟南芥属和芸苔属质体的基因组苯基相同，可以使用拟南芥属的质体转化载体和表达盒以有助于不加修饰地用于芸苔属种群的质体转化和外源基因表达。
得自进化上远缘物种的某些质体表达信号在拟南芥属和芸苔属质体中具有功能。这个发现由实施例Ⅰ所描述的证明烟草Prrn/TpsbA盒可以用于拟南芥属质体中选择性壮观霉素抗性基因(aadA)表达的结果所支持。但是，并非每个烟草表达信号均可在拟南芥属中正确地发挥功能。除已用信号Trps16所替代的终止信号TpsbA外，用与pGS31A相同的载体进行的研究对质体转化体的获得具有巨大影响。这个质粒基因通过在pGS7载体寻靶位点中插入Prrn/Trps16盒而获得。见图4，在用这个质粒所轰击的416个样品中获得了零个质体转化体。如上所述，当一个Prrn/TpsbA盒(这些盒描述于Staub和Maliag,Plant Journal6:547-553,1994以及Svab和Maliga,1993，其内容作为参考引用于此)用于转化拟南芥属叶片时，在所轰击的210个样品中获得了2个质体转化体。
由于它们之间的分类学关系，拟南芥属种和芸苔属种在组织培养中对植物激素或抗生素的反应相似。因此，由所培养细胞的再生植株通过抗生素抗性进行的转基因系筛选可以基本相同的方案来获得。野生型拟南芥属和芸苔属的叶片或子叶外植体对50mg/L壮观霉素反应，在如表6所述的C培养基上生长大量的野生型未转化组织的愈伤组织。这个反应在烟草叶片组织中明显不同，其中暴露于500mg/L壮观霉素导致苗诱导培养基上愈伤组织的增殖被严重抑制。因此，烟草质体(以及核基因)转化体可在含壮观霉素500mg/L的苗诱导培养基上轻易再生(Svab和Maligam,1993)。不幸的是，在含壮观霉素的苗/胚再生培养基C(见表6)上快速的愈伤组织增殖妨碍拟南芥属和芸苔属质体转化体的回收。必须改善培养条件来抑制愈伤组织的快速生长从而帮助质体转化体的回收。这些条件列于实施例Ⅰ中。虽然用实施例Ⅰ的方法可实现筛选且获得了质体转化体，但产生的转质体基因组植株是不育的。但是，已知芸苔属对2,4-D有较高耐受性(Radke等，1992)，在实施例Ⅰ中所描述的相同方案可适用于芸苔属。
实施例Ⅱ中的数据表明所述的再生方案对卡那霉素筛选是适合的。据此，卡那霉素是十字花科分类组别中质体转化体筛选所偏爱的抗生素。
实施例Ⅰ和实施例Ⅱ公开了用于从拟南芥属叶片和子叶再生转基因植株的方案、芸苔属转基因植株再生的方案对于叶片可包括一个两阶段方案(应用两种不同的培养基)，对于子叶则是一个三阶段方案(应用三种不同的培养基)。实施例Ⅱ所描述的用于拟南芥属子叶质体转化的三阶段方案适用于芸苔属。所以以下仅描述两阶段方法中芸苔属叶片质体的转化方法。芸苔属中运用叶片作为靶组织及以卡那霉素抗性为选择标记的质体转化芸苔属阶段Ⅰ的培养导致叶片或子叶中均一细胞分裂的诱导。阶段Ⅱ的目的是转基因植株再生。适合诱导细胞分裂的阶段Ⅰ培养基是在实施例Ⅰ和Ⅱ中讨论过的ARMⅠ培养基。适合的阶段Ⅱ再生培养基是表6中所列的B培养基(Marton和Browse中的ARMⅡ,1991),C培养基(本研究)以及E培养基(Pelletier等，1983)。表6阶段Ⅱ芸苔属植株的再生培养基*培养基 B培养基C培养基E培养基基本盐分Ms Ms Ms维生素 B5 B5 B5NAA - 0.11.0IAA 0.1 - -BAP - 1.0 -2iP 4.02.01.0GA3 - - 0.02蔗糖30g30g30g琼脂(TC)7g 7g 7gpH 5.85.85.8*所有组分均以mg/L计。B培养基与Marton和Browse(1991)中的ARMⅡ相同；C培养基是本研究的培养基；E培养基是Pelletier等(1983)的十字花科再生培养基。
为筛选质体转化体，应将甘蓝型油菜栽培品种Westar的种子表面消毒，并如实施例Ⅱ中对拟南芥属的描述在Magenta盒中无菌萌发。三到四周后，采摘叶片，直接置于琼脂固化的非选择性阶段Ⅰ培养基上的滤纸中。如实施例Ⅱ所述，用载有选择性卡那霉素抗性标记的适合的质体转化载体DNA轰击后，这些平板于25℃光照(16小时)培育两天。2天后用一叠消毒刀片在叶片上刻痕，并转至补充有50mg/L硫酸卡那霉素的相同阶段Ⅰ培养基。在另一个实施方案中，可首先用25mg/ml卡那霉素进行筛选。在培养后期，将卡那霉素浓度提高至50mg/ml。在选择性阶段Ⅰ培养基上两周后，将叶片转至其中一种植株再生的阶段Ⅱ培养基。通过选择培养基上它们的快速生长和苗再生来鉴别卡那霉素抗性克隆。卡那霉素抗性可归功于质体转化或卡那霉素标记基因在核基因组中的整合。可通过取自卡那霉素抗性愈伤组织和再生苗组织样品的PCR和DNA凝胶印迹分析对质体转化体加以确认。然后按标准方案使再生苗生根并转至温室土壤中。
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尽管已经描述了本发明的某些实施方案并在以上进行了具体例举，但本发明并不限于这些实施方案。不违背以下权利要求书中申述的范围和精神，可对本发明进行各种修改。
权利要求
1．获得转质体基因组植株的方法，包括a)在有刺激均一细胞分裂的试剂存在下培养所述植物的植物细胞；b)将所述植物细胞转至琼脂固化培养基上的滤纸上；c)将转化DNA传递到所述植物细胞的质体基因组中，所述转化DNA分子含有ⅰ)由来自待转化的所述质体基因组的质体DNA序列组成的多个寻靶区段，所述寻靶区段帮助所述转化DNA同源重组入所述质体基因组；ⅱ)来自质体DNA的5’端和3’端调控序列，它操作性第连接到所述寻靶区段中的选择性标记基因上，所述调控序列有助于选择标记基因的表达和所编码mRNA的稳定，所述选择性标记基因赋予对所述植物细胞的抗生素抗性；ⅲ)来自质体DNA的5’端和3’端调控序列，它操作性第连接到编码外源目的基因的序列上，从而有助于外源目的基因的表达及所编码mRNA的稳定；并且ⅳ)用于将所述外源基因邻近所述选择性标记基因插入的至少一个克隆位点，所述插入不干扰所述选择性表型的所述赋予及质体侧翼基因的功能；d)将按步骤(c)的方法转化的细胞以高密度转至培养基上培养预定的时间；所述培养基含有促进均一细胞分裂继续进行和植株再生的试剂；e)将按步骤(d)处理的所述细胞转至含所述再生促进试剂和所述抗生素的琼脂固化培养基中，所述转化细胞通过所述选择性标记基因的表达被赋予对所述抗生素的抗性；并且f)选择具转化质体基因组的细胞并从中诱导植株再生。
2．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述转化DNA用选自以下的方法传递用DNA包裹的粒子生物发射法轰击所述细胞、CaPO4介导的转染、电穿孔以及聚乙二醇介导的DNA吸收。
3．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述植物细胞从包括子叶细胞、叶片细胞、胚轴细胞和根细胞。
4．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述选择性标记基因和所述外源目的基因组成一个单顺反子表达单位。
5．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述选择性标记基因和所述外源目的基因组成一个多顺反子表达单位。
6．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述质体是叶绿体。
7．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述抗生素选自卡那霉素、壮观霉素和链霉素。
8．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述促进均一细胞分裂的试剂选自NAA、2AA和2,4-D。
9．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述促进再生的试剂选自BAP、21P、IPA和KIN。
10．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述转化DNA被克隆在载体pGS31A中。
11．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述转化DNA被克隆在载体PGS85A中。
12．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述转化DNA被克隆在载体pGS7中。
13．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述植物是拟南芥。
14．如权利要求1所要求保护的方法，其中所述植物是甘蓝型油菜。
全文摘要
本发明提供获得转质体基因组拟南芥属植物和芸苔属植物的方法与组合物。具体地说,本方法提供有助于导入外源有益DNA分子后转化植株再生的培养方案和组合物。
文档编号C12N15/31GK1222934SQ97194333
公开日1999年7月14日 申请日期1997年3月6日 优先权日1996年3月6日
发明者P·马利加, S·R·思克达, S·V·雷戴 申请人:拉杰斯大学