专利名称：生产和转化木薯原生质体的方法
遗传修饰或转化是向商业上感兴趣的基因型或克隆中加入一种或几种基因的技术。原则上，一个成功的转化系统需要一个从特定植物部分(茎、叶、节等)或从这些部分产生的原生质体(无细胞壁的单个细胞)形成新植物的有效系统，一个将DNA分子转移给植物部分或原生质体的系统和一个选择含有并表达导入基因的组织和植物的系统。
原则上，原生质体是最理想的DNA传递系统。它们可作为单细胞进行培养，该单细胞产生多细胞集落，从该多细胞集落发育成植物。
原生质体产生的植物在起源上一般是纯系的。这给任意转化系统提供了有用的工具，因为它消除了转基因植物中的嵌合状态。
木薯极难进行原生质体的植物再生。从木薯原生质体再生幼苗只有一例报道(Shahin和Shephard,1980)。他们使用充分伸展的叶片用于分离原生质体。尽管付出了相当大的努力，但此后未能重复从原生质体(从叶，茎和根分离出)再生植物(Anonymus,1985；Nzoghe,1991；Anthony等，1995；Sofiary,1996)。一种逻辑探索是使用含胚发生细胞的组织，发现该细胞存在于顶端分生组织，幼叶或在补充了生长素的培养基中培养的体细胞胚中(Stamp和Henshaw,1987a；Raemakers等，1993a)。然而，从这些组织分离的原生质体在最佳情况下产生绿色愈伤组织和不定根(Sofiari,1996)。最近，建立了一种新型的体细胞胚发生。其中，在体外系统中，胚发育不超过球形期(球形前期)，且胚发生愈伤组织具有高度脆性(Taylor等，1995)。将这种脆性胚发生愈伤组织(FEC)转移到液体培养基中产生悬浮样培养物。在韭菜(Buitenveld和Ceemers,1994)，矮牵牛属植物(Power等，1979)，水稻(Kyozuka等，1988)，甘蔗(Chen，等，1988)和小麦(Chang等，1991)中，该培养物是原生质体再生的最佳来源。
我们现在发现在木薯中，FEC是至今可分离出能再生成植物的原生质体的唯一组织。
因此，本发明提供了一种生产木薯或近亲物种的原生质体的方法，该原生质体可再生成植物，该方法包括从木薯或近亲物种的外植体产生脆性胚发生愈伤组织并从所说的脆性胚发生愈伤组织分离原生质体。正如下文所述，似乎为了获得合适的原生质体，将FEC在溶液中培养是十分重要的。因此，本发明进一步提供了一种在液体培养基中培养脆性胚发生愈伤组织的方法。
优选经过对植物细胞进行细胞壁的酶促分解来生产原生质体。因此，本发明提供了一种使用诸如纤维素酶，果胶溶酶和/或离析酶等细胞壁降解酶的混合物生产原生质体的方法。
还可见当获取外植体的植物被预处理时根据本发明的方法产生最佳效果。因此，本发明提供了一种如下所述用生长素预处理获取外植体的植物的方法。
优选在外植体上诱导的胚发生产生了本发明的方法，以该方法从鱼雷形初生或成熟胚产生脆性胚发生愈伤组织。其原因在详细描述中解释。以上面公开的方法获得的原生质体也是本发明的一个部分。
需要能再生成植物的原生质体的一个重要原因当然是原生质体容易被转化或转导或以任何其它合适的方法提供额外的遗传信息。因此，人们现在能够提供带有感兴趣的遗传物质的木薯植物或近亲物种。因此，本发明还提供了一种经过用含有所说的额外遗传信息的细菌，如根癌土壤杆菌来感染，经过电穿孔或化学穿孔提供含有所说的额外遗传信息的载体或经过用包被有额外遗传信息的颗粒进行粒子轰击给所说的原生质体提供额外的遗传信息来转化(定义为以任何合适的方式提供)木薯或近亲物种的原生质体的方法，以此转化从脆性胚发生愈伤组织获得的原生质体。本发明还包含以该方法获得的转化的原生质体。
下面对转化植物，如木薯的用途提供了一个简短的说明。
植物基因技术的应用包括从分离有用基因，其鉴定和操作到向植物再导入修饰的构建体的多种不同的技术(Lonsdale,1987)。植物基因技术可加快植物育种的进程，这可用一些转基因庄稼的例子，如水稻(Chen等，1987；Shimamoto等，1989)，玉米(Gordon-kamn等，1990；Vain等，1993)，小麦(Marks等，1989)，和土豆(DeBlock,1988；Visser等，1989)来举例说明。基因技术的迅速进展使得能洞悉植物病理识别的复杂分子机制和宿主植物的天然防御策略。该技术也可用于控制和有效鉴定所需基因型，远远超出了传统育种的可能性。
例如，对悬浮培养物产生的原生质体进行电穿孔导致转化玉米(Rhodes，等，1988)，水稻(Torigama等，1988)和鸭茅(Horn等，1988)。
已成功地尝试了增强对致病病毒，如烟草中的烟草花叶病毒组(Powel Abel等，1986)，马铃薯(Hoekema等，1989)和番木瓜(Fitch等，1993)中的马铃薯X病毒组的抗性。在上面例子中，导入的性状以表达编码包膜蛋白的单个基因为基础。在木薯中，经过包膜蛋白介导的抗性技术可控制非洲木薯花叶病毒(ACMV)和木薯普通花叶病毒(CCMV)(Fauquet等，1992)。已克隆了编码生氰作用关键酶的基因(Hughes等，1994)，这使得使用反义方法以遗传信息控制木薯生氰作用成为可能。本发明的另一实施方案是控制木薯块茎中的淀粉。
因此，本发明提供了一种转化的原生质体，其中额外的遗传信息包括一种反义构建体，特别是能抑制直链淀粉合成途径的反义构建体。
原生质体不能在野外生长，也不能收获。尽管原生质体对于转化是必需的，但必须能从所说的原生质体再生成胚和/或植株。这是本发明的一个非常重要的实施方案，因为已表明木薯难以从原生质体再生。详细描述部分解释了如何完成这一方案。至于进一步的信息，参考E.Sofiari写作的题为《木薯(Manihot esculenta Crantz)的再生和转化》的论文，其复印件随本申请一同提交，该论文尚未出版，本文引用作为参考。因此，本发明提供了以原生体再生植物的方法，其中诱导本发明的原生质体产生胚，随后诱导该胚产生植物。
以所说的方法获得的植物也是本发明的一个部分，特别是块茎中基本上不含直链淀粉的植物。
详细描述fec的发生获得FEC的方法在
图1中列出。它从初生胚的诱导开始。初生胚以两步程序形成。在第一步中，在补充了盐和维生素(优选Murashige和Skoog(1962))，糖源(例如20g/l蔗糖)和生长素(例如，1-8mg/l毒莠定或麦草畏或2,4-D)的培养基中培养外植体用于发生胚。在该第一培养基中培养10至15天后，形成两极鱼雷形胚。鱼雷形胚具有清楚的下胚轴和子叶原基。将带有鱼雷形胚的外植体转移到第二步培养基(与第一步的培养基相同但不含生长素)中后，鱼雷形胚生长成熟。成熟的胚具有较大的绿色子叶。可使用合子胚(Stamp和Henshaw 1982；Konan等，1994)，幼叶外植体或顶端分生组织(Stamp和Henshow,1987a；Szabados等，1982；Mroginsky和Scocchi,1993；Ralmakers 1993a；Narayanaswamy等,1995)和叶组织(Mukherjee 1995)获得初生胚。以这种方式评价许多不同基因型形成初生胚的能力。以这种方法仅在固体培养基中培养后形成初生体细胞胚且在液体培养基中培养后不形成。而且，如果使用生长素毒莠定，麦草畏或2,4-D且不用IAA,IBA或NAA仅观察到体细胞胚(初生)。
在目前使用的方法中，每个培养的外植体形成的许多成熟胚中有基因型变异。基因型M.Coll505,M.Col22和Gading每个培养的叶外植体产生最高数目的成熟胚(ME/CLE)。然而，形成的成熟胚数目较低。在M.Col22中，从体外生长的植物分离的且在含4mg/l 2,4-D的步骤1的培养基中培养的叶外植体中最多有22％形成ME，且最大数值为0.8ME/CLE。在含8mg/l 2,4-D的步骤1培养基中，最多49％的叶外植体形成ME，且最大值为3.5ME/CLE。更高的2,4-D浓度不能进一步提高外植体的胚发生能力。
在提高叶外植体产生初生体细胞胚能力的尝试中，供体植物在不同条件下生长。供体植物在不同光照方案(8,12,16或24小时)下的体外生长对胚发生反应无影响。然而，光强度的减少具有正影响。用从在8μEm-2S-1下生长的供体植物分离的且在步骤1培养基上培养的叶外植体获得最佳结果。其他的研究者已显示在某些基因型中，在诱导初生胚发生时，麦草畏(1-66mg/l)和毒莠定(1-12mg/l)优于2,4D(Ng 1992；Sudarmonowati和Henshaw,1993；Taylor和Henshaw,1993)。Mathews等(1993)经过在步骤1培养基中培养15天后将外植体转移到补充了0.5％活性炭的无生长调节剂的培养基中提高了基因型M.Coll505的初生胚发生效率。在该培养基中促进了成熟，结果成熟胚的数量从对照的0.4增加到3.4ME/CLE。
如果用诸如2,4-D或毒莠定或麦草畏的生长素预处理供体植物可获得最佳结果。为此，在生长12天后，植物在补充了生长素(终浓度为8mg/l)的液体MS20培养基中生长。2天后从供体植物分离叶外植体并在含有8mg/l 2,4-D，毒莠定或麦草畏的步骤1培养基中培养。在克隆M.Col22中，这产生9.4ME/CLE的产率。它比用于处理的对照植物明显要高，后者产生3.5ME/CLE(表3)。
对一些不同的基因型试验了生长素预处理的一般适用性。供体植物未作预处理时，两种基因型形成ME但频率较低。预处理供体植物后，几乎所有的基因型的叶外植体均形成ME。
最终我们从22种试验的基因型中的18种(表1，除了TMS30221,TMS30001,TMS30572和SaoPaolo)获得了成熟的初生体细胞胚。
从合子胚和叶产生的初生体细胞胚用作产生次生胚的外植体(Stamp和Henshaw,1987b；Szabados等，1987；Mathews等，1993；Raemaker等，1993bc；Luong等，1995)。在补充了生长素的培养基中连续培养体细胞胚产生体细胞胚发生的循环系统。为导致次生胚发生而传代培养体细胞胚的方式似乎影响胚发生组织的形态。每月在含2,4D的固体培养基中于黑暗中再培养的体细胞胚团发育成在旧胚顶端形成的指状胚原始体。该胚不经过鱼雷形阶段。如果将具有胚的细胞团转移到光照下的第2步培养基(Szabados 1987)中则出现进一步发育。正常情况下，成熟体细胞胚在光照下的步骤1培养基中培养，20天后，将外植体转移到步骤2的培养基中用于成熟。
在该系统中胚发育至成熟且具有大型绿色子叶的成熟胚用于起动新的胚发生循环，而在其它系统中，鱼雷形胚用于起动次生体细胞胚发生的新循环。
在表1所述基因型的14个中试验了成熟胚繁殖的这一系统。尽管事实是大多数基因型中只获得了几个成熟的初生胚，但除了一个外，所有的基因型在补充了2,4-D的培养基上培养后比观察的初生体细胞胚发生以更高的频率产生新的成熟胚。经过对成熟胚定期传代培养1年以上可保持胚形成力(Szabados等，1987；Mathews等，1993；Raemakers,1993)。在液体和固体培养基中均形成新的体细胞胚。在所有基因型中，观察到在液体培养基中比在固态培养基中形成更多的胚，且在开始新一轮次生体细胞胚发生前将胚分成多部分比完整的胚增加了产量。例如，在M.Col22中，在固态培养基上培养的完整胚每个培养胚产生8个胚，而在液体培养基中培养的分成小部分的胚每个培养胚产生32个胚(Raemakers等，1993c)。不仅2,4-D，毒莠定和麦草畏，而且NAA均具有诱导次生胚发生的能力。IBA和IAA不能诱导次生胚发生。NAA已成功地用于Adira 1,Adira 4,Gading,Linell,M.Col22,M.Coll505,TMS90853和Gading。一般来说，在补充了NAA的培养基中比在补充了2,4-D，毒莠定或麦草畏的培养基中产生更多的成熟胚。而且，用NAA诱导的胚的发育比用2,4-D，麦草畏或毒莠定诱导的更快。缩短培养期间具有有益的效果，特别是当大规模操作时。
在组织学上，以2,4-D新诱导的次生胚垂直附着于外植体上，而以NAA新诱导的次生胚水平附着。
在获得木薯的胚发生培养物时还存在一个问题(Mroginski和Scocchi,1992；Taylor等，1992；Narayanaswamy等，1995；Sudarmonowati和Bachtiar,1995)。主要问题不是从原代外植体获得胚发生组织，而是以次生胚发生大规模繁殖该组织。为此目的，可使用由鱼雷形胚组成的组织或成熟胚的任意一种。鱼雷形胚的繁殖具有高度基因型依赖性，而成熟胚的繁殖极大地独立于基因型(Raemakers,1993)。初生和次生体细胞胚发生的特征均在于形成具有两极结构的繁殖体。这些两极鱼雷形胚在补充了生长素的步骤1培养基中已形成。因此，Taylor等，(1995)建议使用术语组织化的胚发生。组织化的细胞定义为一组活跃分裂的细胞，具有组织和器官，形成一个特征性统一的整体(Walker,1989)。
Taylor等(1995)开发了组织化程度较低类型的体细胞发生。用连续选择，在补充有盐和维生素及10mg/l毒莠定(GD2)的Gressoff和Doy(1972)培养基中培养的组织化的胚发生组织逐渐转变成组织化程度较低的组织。该组织由(前期)球形胚的愈伤组织样团块组成。它具有极大的脆性。因此，这些组织称为脆性胚发生愈伤组织(FEC)。FEC中的细胞在一定阶段是连续的，然后它们从组控制中分离出来，因为它们没有组织化形成统一的结构。在由Gresshoff和Doy(1972)维生素和盐，7g/l Daichin琼脂，20g/l蔗糖和10mg/l毒莠定组成的培养基(固体GD2)上维持FEC。每隔3周将脆性胚在上述培养基中传代培养。为了进行液态悬浮培养，将0.5g脆性胚转移进含有50ml补充了Schenk和Hildebrandt(1972)盐和维生素，60g/l蔗糖和10mg/l毒莠定的液态培养基(液体SH6)的200ml瓶中。每隔2天更新一次培养基，14天后，将每瓶中的培养物分配进5个新瓶中。高压灭菌前将PH调成5.7。生长室的温度为30℃，光周期12小时且辐照度为40μmolm-2s-1。经过在补充有6％(w/v)蔗糖和10mg/l毒莠定的Schenk和Hildebrandt(1972)培养基(SH6)中培养FEC产生悬浮培养物。每隔2-3天更换该培养基。
为了保持培养物的高度脆性状态，必须每隔2月将FEC筛选一次。实践中将通过具有1mm2网眼的筛子的FEC部分用于传代培养。
FEC在GD2或SH6培养基中几乎不形成鱼雷形胚。如果FEC在成熟培养基上培养则形成鱼雷形和随后的成熟胚。成熟培养基由Murashige和Skoog(1962)盐和维生素，0.1g/l肌醇，20g/l蔗糖，18.2g/l甘露醇，0.48g/l MES,0.1g/l酪蛋白水解产物，0.08g/l腺嘌呤硫酸盐，0.5mg/l d-泛酸钙，0.1mg/l氯化胆碱，0.5mg/l抗坏血酸，2mg/l尼克酸，1mg/l盐酸吡哆醇，10mg/l硫胺素HCl,0.5mg/l叶酸，0.05mg/l生物素，0.5mg/l甘氨酸，0.1mg/l L-半胱氨酸，0.25mg/l核黄素和1mg/l毒莠定组成。该成熟培养基每3周更新一次。
经过在补充了2,4-D，毒莠定，麦草畏或NAA的MS20培养基上培养可将成熟胚诱导成次生体细胞胚发生。在范围较宽的基因型(见表1)中相当容易建立初生和次生体细胞胚形成，而FEC现仍局限于少数基因型。FEC用于体细胞胚发生和遗传转化的新系统的前景是有希望的，尽管还需要进一步的研究使该系统适用于更多的基因型。为该方法所必需的是提供高质量组织化的组织和该组织转变成FEC的能力。Taylor等(1995)使用“组织化的组织”，它在鱼雷形期繁殖以起动FEC。在这种情况下，2个步骤(起动组织化的组织和转变成未组织化的组织)对于成功起动FEC是决定性的。两个步骤是基因型依赖性的。如果组织化的组织在Raemakers(1993)所述的成熟期中繁殖，那么只有该组织转变成FEC的能力是起动FEC的决定性步骤。需要研究的是组织化的组织是否可用作起始材料。如果组织化的组织不能使用，那么该组织应在其可用于起动FEC前首先在未成熟期繁殖。经过以高密度培养外植体或经过减少循环时间容易实现这一点。
从原生质体再生植物原生质体的分离为了分离原生质体，可使用在固态GD2或液体SH6中培养的FEC。然而，从在液态SH6中培养了1至3周的FEC获得最高产量的原生质体。
将2克FEC放入含10ml细胞壁消化溶液的培养皿(φ9cm)中。细胞壁消化溶液由细胞壁降解酶的混合物10mg/l溶果胶酶，10g/l纤维素酶，200mg/l离析酶；生长调节剂(NAA 1mg/l,2,4-D 1mg/l，玉米素1mg/l)；主要盐(368mg/l CaCl2；34mg/l KH2PO4；740mg/lKNO3；493mg/l MgSO4.7H2O)和渗压剂(91g/l D-甘露糖)和0.5g/lMES组成。细胞壁降解酶纤维素酶(1-10g/l)加离析酶(200mg/l)成功地用于原生质体分离。额外添加溶果胶酶(0.001-0.01g/l)和/或Driselase(0.02g/l)增加了原生质体的产率。培养18小时后，向溶液中加入10ml洗涤培养基。摩尔渗透压浓度为0.530m Osm/kg的洗涤培养基由主要盐(见细胞壁消化溶液)，45.5g/l甘露醇和7.3g/l NaCl组成。消化组织通过73μM孔经滤器(PA55134 Nybolt-Switzerland)过滤进250ml烧杯中。过滤物平均分配进2个12ml的圆锥形螺盖管中，并在600rpm下离心3分钟(Mistral 2000)。去掉上清后重复一次洗涤程序。经过漂浮在9.5ml含主要和微量盐(见细胞壁消化溶液)及105g/l蔗糖的溶液中重悬原生质体溶液。PH为5.8，摩尔渗透压浓度为0.650mOsm。在顶部轻轻加入0.5ml洗涤培养基前使含原生质体的溶液平衡5分钟。在700rpm下离心15分钟(Mistral 2000)后，原生质体浓缩在蔗糖和洗涤培养基之间的带中。用吸管收获原生质体层且在标准血细胞计数器室中计数产量。
原生质体培养在用琼脂糖0.2％w/v固化的培养基(Dons en Bouwer,1986)中在含10ml相同液体培养基的培养皿中培养原生质体。下列培养基导致形成小愈伤组织
-仅补充了生长素(0.1-10mg/l NAA或0.1-10mg/l毒莠定，或0.1-10mg/l IAA，或0.1-10mg/l 2,4-D，或0.1-10mg/l麦草畏，或0.1-10mg/l，或0.1-10mg/l)或补充了生长素加细胞分裂素(0.01-1mg/l玉米素，0.01-1mg/l 2-ip,0.01-1mg/l BA,0.01-1mg/l TDZ,0.01-1mg/l细胞分裂素)的TM2G培养基(Wolters等，1991)。
-仅补充了生长素(0.1-10mg/l NAA或0.1-10mg/l毒莠定，或0.1-10mg/l IAA，或0.1-10mg/l 2,4-D)，或补充了0.1-10mg/l麦草畏加细胞分裂素(0.01-10mg/l玉米素，0.01-10mg/l 2-ip,0.01-1mg/lBA,0.01-1mg/l TDZ,0.01-1mg/l细胞分裂素)的培养基A(Murashige和Skoog(1962)盐和维生素，4.5g/l肌醇，4.55g/l甘露醇，3.8g/l木糖醇，4.55g/l山梨糖醇，0.098g/lMES,40mg/l硫酸腺嘌呤和150mg/l酪蛋白水解产物，0.5mg/l d-泛酸钙，0.1mg/l氯化胆碱，0.5mg/l抗坏血酸，2.5mg/l尼克酸，1mg/盐酸吡哆醇，10mg/l硫胺素盐酸，0.5mg/l叶酸，0.05mg/l生物素，0.5mg/l甘氨酸，0.1mg/l L-半胱氨酸和0.25mg/l核黄素及59.40g/l葡萄糖。
经过用新鲜培养基更换9ml培养基实现每隔10天更新一次培养基。在第一培养基中培养2个月后，选择高质量的FEC并培养以便进一步增生或使其成熟。为了增生，将FEC转移到补充了40g/l蔗糖，7g/l Daichin琼脂和2mg/l毒莠定的Gresshoff和Doy(1974)培养基(GD4)中。3周后，将FEC转移进补充了20g/l蔗糖，7g/l琼脂和10mg/l毒莠定的Gresshoff和Doy培养基(GD2)中。经过将1.0g FEC转移进补充了10mg/l毒莠定的液体SH6％培养基中起动悬浮培养物。2周后，将悬浮液分配到具有1.0ml原始细胞叠集体积的新瓶中。
培养2个月后，在补充了0.5mg/l NAA和1mg/l玉米素的TM2G中以105/ml的密度培养的104个原生质体产生了1058个小愈伤组织而以106/ml的密度培养的104个原生质体仅产生了64个小愈伤组织。
以培养基A代替TM2G培养基明显降低了小愈伤组织的密度和数目。此阶段至少可分辨3种类型的愈伤组织。一种类型由球形胚组成，在以106密度培养的原生质体中观察到的最多。其中的一些发育成亮绿色的子叶状结构。然而，这些胚不能正常发芽。另一类型是快速生长胚且由大型致密愈伤组织组成，它们在两种密度的原生质体培养物中都能观察到。这种愈伤组织不会发育成胚。第3种类型是高脆性愈伤组织，它在两种密度中都观察到。在2-5×105的密度下(培养基TM2G)，大约60％的愈伤组织是脆性的且具有胚形成能力。将FEC进行传代培养用于进一步繁殖或使其成熟。
原生质体产生的FEC的增生选择FEC后，将其0.1g在GD4加2mg/l毒莠定中培养3周使其增加到0.7g组织。超过95％的组织由高质量FEC组成。随后，经过在补充了10mg/l毒莠定的GD2培养基中传代培养3周维持该组织。为了起动悬浮培养，将FEC转移进液体培养基中。该材料细胞叠集体积(PCV)的增加略高于原始材料(数据未显示)。
原生质体产生的FEC的成熟在尝试诱导胚成熟时，将在GM2G中培养2个月后分离的FEC在成熟培养基上培养。成熟培养基由Murashige和Skoog(1962)盐和维生素，0.1g/l肌醇，20g/l蔗糖，18.2g/l甘露醇，0.48g/l MES,0.1g/l酪蛋白水解产物，0.08g/l腺嘌呤硫酸，0.5mg/l d-泛酸钙，0.1mg/l氯化胆碱，0.5mg/l抗坏血酸，2mg/l尼克酸，1mg/l盐酸吡哆醇，10mg/l硫胺素盐酸，0.5mg/l叶酸，0.05mg/l生物素，0.5mg/l甘氨酸，0.1mg/lL-半胱氨酸；0.25mg/l核黄素和1mg/l毒莠定组成。该成熟培养基每隔3周更新一次。
在该培养基中逐渐从增生转变成成熟。结果在液体成熟培养中培养2周后用因子4增加细胞叠集体积。转移到固态成熟培养基中后还有增生。在固态培养基中培养2周后，大部分胚胎达到球形，且只有少数一些球形胚进一步发育。在固态成熟培养基中培养1个月后，可见第一鱼雷形胚。成熟和鱼雷形胚的数目与涂布效率不相关但与起始培养的原生质体密度相关。如果原生质体在无生长调节剂的TM2G上培养则不能获得这种胚。从在补充了0.5mg/l NAA和1mg/l玉米素的TM2G上培养的原生质体形成的成熟和鱼雷形胚的数目最高。如果用毒莠定代替NAA，那么鱼雷形和成熟胚的数目明显更低(表2)。对于试验的毒莠定，2mg/l的浓度产生最佳结果。培养3个月后，每滴琼脂糖分离出60至200个鱼雷形成熟胚。鱼雷形胚如果在新鲜的成熟培养基或在MS2加0.1mg/l BAP上培养则以高频率变成熟。
次生体细胞胚形成和原生质体产生的成熟胚的萌发如果在补充了10mg/l NAA或8mg/l 2,4-D的液态或固态MS2培养基上培养则只有少数鱼雷形胚形成次生胚(数据未显示)。对于次生胚发生，成熟胚是较好的外植体。在液态和固态培养基中，对于诱导次生胚发生，2,4-D优于NAA。如果成熟胚首先在2,4-D中培养，然后在液态NAA中培养则反应相当于在单独的2,4-D中培养。首先在含2,4-D的培养基中进行了一轮次生体细胞胚发生的胚在补充了10mg/l NAA的MS20中产生高效的次生胚。
比较了生长素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)或萘乙酸(NAA)在液体培养基中诱导循环或次生体细胞胚的萌发。然而，为了获得高萌发率，干燥胚需要补充诸如苄氨基嘌呤(BAP)的细胞分裂素的培养基。产生的籽苗形态学依赖于BAP的浓度，用1mg/l BAP形成具有粗而短的直根和具有短节间的分枝枝条的植物。用0.1mg/l BAP时，直根细而长且枝条仅具有1个或2个顶端分生组织。如果胚的干燥达到最适度以下，比胚干燥达最适度时需要更高浓度的BAP以刺激萌发。在黑暗中培养的干燥胚也需要低浓度的BAP，而且，这些胚比在光照下培养的胚萌发更快。开始体细胞胚诱导4周后获得完整的植物。2,4-D诱导的胚显示出不同的反应。仅在一种基因型中，干燥增强2,4-D诱导的胚萌发，而在3种其它基因型中不增强。在所有基因型中，干燥刺激根形成。在黑暗中培养的胚主要形成不定根，而在光照下培养的胚主要形成直根。
4.0基因转移系统在过去几年中，已形成了一些对植物原生质体的DNA转移技术，如硅纤维(Kaeppler等，1990)，显微注射(Deleat和Bleas,1987)和电泳(Griesbach和Hammond,1993)。最常用且有效适用的技术是土壤杆菌介导的基因转移，微粒/粒子轰击和原生质体电穿孔。
根癌土壤杆菌DNA传递系统是最常用的技术。它可能涉及以该方法在植物中进行DNA传递的第一个发明。起初它局限于伽蓝菜属和茄科，特别是烟草。现今，土壤杆菌介导的转化的使用有了显著的变化，它可转化除在单子叶植物中受限制外的大范围的植物(Wordragen和Dons,1992的综述)。尽管木薯是土壤杆菌属的宿主，但已证实对其并非极易操作。
原则上原生质体是DNA传递最理想的外植体。它们可以单细胞的形式培养以产生多细胞集落，然后发育成植物。从原生质体产生的植物在起源上一般是纯系的，这给任意转化系统提供了有用的工具，因为它消除了转基因植物中的嵌合状态。然而，使用原生质体受具有高度物种依赖性的再生系统的牵制。为进行转化，可联合使用原生质体与PEG以改变质膜，它引起可逆性通透，使DNA进入细胞质，正如在例如Lolium multiform(Potryk以等，1985)和Triticummonococcum(Lorz等，1985)中所证实的。增加质膜甚至细胞壁对DNA的通透性的另一技术是用电穿孔(见Jones等，1987的综述)，在该方法中电脉冲使DNA能进入细胞。水稻是从原生质体电穿孔产生可育转基因植物的第一种庄稼(Shimamoto等，1989)。
使用粒子轰击或biolistics传递外源DNA提供了在木薯转化中的一个可供选择的方法。使用该方法获得的第一种转基因植物是烟草(Klein等，1989)。在这一成功的转化方法后，粒子轰击广泛用于对土壤杆菌感染不易操作的植物中，特别是单子叶植物。加速粒子(微粒)的一些DNA传递装置的改进产生了最近的型号BiolisticTM PDS-1000(Bio-Rad实验室，Richmond,Ca)。这些装置可以商业上买到，然而，目前的价格相当高。用DNA包裹的钨或金颗粒通常用作将DNA传递给靶组织的微粒(见Songstad等，1995的最近综述)。
5．选择和报道基因用于遗传修饰为了能鉴定转化细胞，将感兴趣的基因与选择标记基因偶联。该标记基因对于选择转化细胞是必需的。选择可根据转化细胞/组织的视觉特征来进行。一个例子是从萤火虫分离的萤光素酶基因。表达该基因且提供了底物(萤光素)的植物细胞会发光，可用特殊仪器检测(Ow等，1986)。选择转化的组织的另一种方法是导入编码对抗生素或除草剂有抗性的基因(Thompson等，1987；Gordon-Kamm等，1990)。
许多抗生素和除草剂已用作植物转化的选择剂。在禾谷类中，选择对除草剂膦丝菌素(PPT)的抗性来选择转基因植物(Cao等，1990)。在番木瓜(Fitch等，1994)，葡萄(Nakano等，1994；Scorza等，1995)，玉米(Rhodes等，1998)和水稻(Chen等，1987)中，赋予对卡那霉素和有关抗生素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因用作选择标记。
在木薯中，可使用所有上述的选择系统，然而以PPT为基础的选择具有优势，它增强了FEC形成成熟胚的能力且以这种方式增强了植物的再生。
对图1的说明图1在木薯中体细胞胚发生的示意图，包括初生，次生体细胞胚发生，脆性胚发生愈伤组织的选择，成熟和干燥，接着是萌发。
gd2=补充了Gresshoff和Doy盐(1974)和维生素加20g/l蔗糖的培养基。
gd4=补充了Gresshoff和Doy盐(1974)和维生素加40g/l蔗糖的培养基。
ms2=补充了Murashige和Skoog盐和维生素加20g/l蔗糖的培养基。
pic=10mg/l毒莠定，NAA=10mg/l萘乙酸，2。4-D=8mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸，sh6=补充了Shenk和Hildebrandt(1972)盐和维生素加60g/l蔗糖的培养基。
表1用于体细胞胚发生的木薯基因型Indonesia Nigeria TMS90853 M.Col22,Adira1TMS50395TMS30555 ZimbabweTjurugTMS60444TMS30211 Line11Adira4TMS90059TMS30395 VenuzuelaMangi4TMS30572TMS30001 M.Ven77GadingTMS4(2)1244 Columbia BrasilFarokaTMS60506M.Col1505 Sao Paolo表2供体植物体外生长期间光强度对相应于成熟胚形成的叶外植体数和每个培养的叶外植体成熟胚数(#ME/CLE)的影响光强度 外植体数相应的外植体a产量(μEm-2s-1) (#ME/CLEb)40 48 18b 1.7b28 48 26ab 4.9ab848 31a 6.6aa,b具有相同字母的平均值分别用卡方检验(p＜0.1)和用LSD检验(p＜0.1)无显著的差异。
表3 2,4-D预处理对11种尼日利亚木薯基因型和M.Col22中初生成熟胚的产量(每个从体外植物分离的培养的叶外植体的成熟胚数)及随后由次生体细胞胚发生的成熟胚繁殖的影响胚发生 初生a)次生b)2,4-D预处理无 有M.Col223.59.413.5TMS 30555 0 0.76.2TMS 50395 0 ＜0.1 5.3TMS 60506 0 ＜0.1 0TMS 90059 0 ＜0.1 7.2TMS 30211 0 0 -TMS 60444 0 1.19.9TMS 30395 0 0.16.7TMS 90853 ＜0.1 0.28.2TMS 4(2)1244 ＜0.1 0 5.4TMS 30001 0 0 -TMS 30572 0 0 -a)三个实验的平均值(总共48-74个叶外植体)，b)两个实验的平均值(总共24-48个ME外植体)。
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权利要求
1.一种生产木薯或近亲物种的原生质体的方法，该原生质体能再生成植株，该方法包括从木薯或近亲物种的外植体产生脆性胚发生愈伤组织并从所说的脆性胚发生愈伤组织分离原生质体。
2.根据权利要求1的方法，其中在液态培养基中培养脆性胚发生愈伤组织。
3.根据权利要求1或2的方法，其中使用诸如纤维素酶，果胶溶酶和/或离析酶的细胞壁降解酶混合物产生原生质体。
4.根据上述权利要求任意一项的方法，其中获得外植体的植物用生长素预处理。
5.根据上述权利要求任意一项的方法，其中脆性胚发生愈伤组织从鱼雷形初生或成熟胚产生。
6.根据权利要求5的方法，其中胚在初生外植体上诱导。
7.由根据上述权利要求的任意一项的方法获得的原生质体。
8.一种转化木薯或近亲物种原生质体以给所说的原生质体提供额外的遗传信息的方法，其是通过用包含所说的额外遗传信息的细菌如根癌土壤杆菌感染，经过电穿孔或化学穿孔提供包含所说的额外遗传信息的载体或经过用额外的遗传信息包裹的粒子进行粒子轰击而进行，其中根据权利要求7的原生质体被转化。
9.以权利要求8的方法获得的转化的原生质体。
10.根据权利要求9的转化的原生质体，其中额外的遗传信息包括感兴趣的基因。
11.根据权利要求9的转化的原生质体，其中额外的遗传信息包括反义构建体。
12.根据权利要求11的转化的原生质体，其中反义构建体能抑制直链淀粉合成途径。
13.从原生质体再生植物的方法，其中诱导根据权利要求7或9-12的任意一项的原生质体产生胚，随后诱导该胚产生植物。
14.从权利要求13的方法获得的木薯植物或其近亲物种。
15.根据权利要求14的植物，其得自权利要求12的原生质体并且其块茎基本上不含直链淀粉。
全文摘要
本发明公开了生产木薯或近亲物种的原生质体的方法,其中该原生质体能再生成植物。该方法包括从木薯或近亲物种的外植体生产脆性胚发生愈伤组织并从所说的脆性胚发生愈伤组织分离原生质体。还公开了转化木薯或近亲物种的该原生质体的方法和由此获得的转化原生质体。公开了从这些原生质体再生植物的方法,和由此获得的木薯植物或近亲物种。
文档编号C12N15/09GK1219202SQ97194813
公开日1999年6月9日 申请日期1997年5月20日 优先权日1996年5月20日
发明者理查德·赫拉尔杜斯·弗朗西斯库斯·菲瑟, 克里斯蒂安·约瑟夫·约翰内斯·拉马克斯, 埃弗特·雅各布松, 约翰娜·伊丽莎白·玛丽亚·贝格沃特－范迪伦 申请人:马铃薯及衍生产品合作销售生产阿韦贝公司