专利名称：水稻细胞转化方法
技术领域：
本发明涉及植物遗传学和基因工程领域。更具体地说，本发明涉及利用农杆菌介导和PMI选择标记来制备转基因水稻的方法。
背景技术：
水稻(Oryza sativa)是全世界一半以上的人口，尤其是亚洲国家人口的主粮。随着人口膨胀和耕地减少，水稻产量越来越难以满足需要。到2050年，世界人口将从现在67 亿人增加到92亿人(联合国，2007)，这就要求到2050年粮食供应还需增加50%。随着半矮秆品种和杂交稻的推广，转基因手段被认为可望成为水稻增产的另一个突破点。2002年水稻全基因组测序完成后，可读框的功能注释和具有农学意义的基因的应用成为了水稻科研人员的主要研究目标。实现这一目的的前提条件是必须开发出高效率的水稻转化系统。 这样的系统必须具有“多、快、好(可重复性高、基于成熟胚)、省”的特征，即能够以更低的成本在更短的时间内产生出更多的可育植株。随着第一批转基因水稻问世以来(Zhang and Wu 1988 ；Toriyama et al. 1988 ； Zhang et al. 1988)，已经通过不同的转化方法，包括花粉管途径(Luo and Wu 1988)、微粒轰击(Christou et al. 1991)、离子束(Yang et al. 1994)等进行了大量的水稻转化研究。目前最常用的转化方法是农杆菌介导法。该方法由Hiei等人(Hiei et al. 1994)建立。在此基础上，已经在粳稻(Chen et al. 1998 ；Enriquez-Obregon et al. 1999 ；Toki et al. 2006)、辛山稻(Lin and Zhang 2005 ；Hiei and Kumar 2006)和爪唾稻(Dong et al. 1996 ；Diah and Anzai 2006)中建立了分别使用来源于成熟胚的愈伤组织或未成熟胚作为外植体的水稻转化系统。但这些转化系统中都需要用到抗生素或除草剂等有毒物质进行选择，对环境有潜在的影响。作为替代，已经有人开发了以磷酸甘露糖异构酶(Pmi)基因作为选择标记，用无毒物质甘露糖作为正选择剂的转化系统(Joersbo and 0kkelsl996)。PMI是首先由Miles和Guest从大肠杆菌中分离出来并测序(Miles and Guest, 1984)。植物利用PMI能够将大部分植物无法代谢的6-磷酸甘露糖形式的甘露糖转化为大多数植物能够代谢的6-磷酸果糖。这样表达pmi基因的植物能够以甘露糖为唯一碳源生长。在农杆菌介导的植物细胞转化中使用pmi标记基因时，用甘露糖进行正选择。与杀死未转化细胞的负选择不同，在正选择中未转化的细胞保持休眠，而经过转化的表达pmi 基因的细胞可以利用甘露糖作为碳源正常生长。这样，在培养过程中不会发生未转化细胞的坏死。由此，再加上碳元素是细胞骨架的重要成分，使得pmi基因在转化中的效率较高。此外，甘露糖在自然界中常见，能够被豆科植物如大豆(Lee and Metheson, 1984)所代谢，因此对植物组织没有不良作用。考虑到这些原因，人们已经在不同科的植物中尝试了使用pmi作为选择标记，例如禾本科的玉米(Negrotto et al. 2000)、珍珠稷(0，Kennedy et al. 2004)、剪股颖(Fu et al. 2005)、高粱(Gurel et al.，2009)、小麦(Wright et al. 2001)、和甘蔗(Jain et al. 2005)；十字花科的拟南芥(Todd and Tague，2001)和卷心菜(Ku et al. 2006)、蔷薇科的苹果(Degenhardt et al. 2006)、番木瓜(Zhu et al. 2005)和杏(Ramesh et al. 2006)；大戟科的木薯(Zhang et al. 2000)、茄科的西红柿(Sigareva et al. 2004)；藜科的甜菜(Joersbo et al. 1998)；百合科的洋葱(Aswath et al. 2006)； 和葫芦科的黄瓜(He et al. 2006) 0由此可见pmi作为选择标记基因在粮食作物新品种的选育中有很大的发展潜力。2009年欧盟已经批准了使用PMI选择系统生产的转基因玉米的进口和加工作为食品和饲料的用途。在水稻转化研究中也已有人使用过pmi选择系统 (Lucca et al. 2001 ；He et al. 2004 ；Ding et al. 2006)，但其报道的转化效率都很低(仅 6%左右)，不适于工业规模的生产。因此，本领域对于以PMI作为选择标记的高效、简便的水稻转化方法存在需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种转化效率高、适用于工业规模应用的向水稻细胞导入外源基因的方法，适用于实施该方法的转化体系，利用该方法制备转基因水稻植株的方法，以及利用上述方法获得的转化水稻细胞、植株部分和植株。本发明提供了下列技术方案来实现该目的。在一个方面，本发明提供一种将外源基因导入水稻细胞的方法，包括下述步骤(1)将水稻谷粒去壳、灭菌后将胚分离出来；(2)取步骤(1)所得的分离的胚置于愈伤组织诱导培养基上在30°C左右暗培养约 2周，以产生次生愈伤组织；(3)将步骤O)中获得的愈伤组织与携带外源基因和磷酸甘露糖异构酶(PMI)标记基因的农杆菌接触20分钟左右；(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到共培养基上，于约23°C培养约48小时；(5)将步骤的愈伤组织置于恢复培养基上培养5天左右；(6)将步骤(5)的愈伤组织转移到含有蔗糖和甘露糖的选择培养基上，在约30°C 暗培养3周左右以获得出芽的愈伤组织；(7)将出芽的愈伤组织转移到再生培养基中继续培养；和任选地(8)在再生培养基中培养约3周的愈伤组织转移至生根培养基中继续培养。在一个实施方案中，所述步骤(1)中的谷粒是成熟谷粒。在一个实施方案中，所述步骤O)中的诱导培养基是说明书表1所列出的NB培养基。在一个实施方案中，所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将所述愈伤组织浸泡在所述农杆菌的悬液中。在一个实施方案中，所述步骤中的共培养基是说明书表1所列出的固体共培养基或液体共培养基。在一个实施方案中，所述步骤(5)中的恢复培养基是说明书表1所列出的NBREC
培养基。在一个实施方案中，所述步骤(6)中的选择培养基是说明书表1所列出的NBPMI
培养基。在一个实施方案中，所述步骤(7)中的再生培养基不含有甘露糖。在一个实施方案中，其中所述步骤(7)中的再生培养基是选自包含如说明书表1所述成分的NBKN、NBKA, NBIZ或NBIK培养基中的任一种，优选NBKN或NBKA培养基。在一个实施方案中，所述任选步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的 1/2MB培养基。在一个实施方案中，农杆菌的悬液是在侵染当天将农杆菌以OD66tl约0. 05-0. 25悬浮包含如说明书表1所示成分的液体滤纸培养基中而制备的。在上述各实施方案的进一步优选的实施方案中，所述选择培养基中含有约 5-12. 5g/L的蔗糖和约5-25g/L的甘露糖，优选含有约5g/L的蔗糖和约12. 5g/L的甘露糖。 更优选地，其中所述选择培养基中不含抗生素或除草剂。在上述各实施方案的进一步优选的实施方案中，所述农杆菌是根瘤农杆菌EHA105 菌株。在上述各实施方案的进一步优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻。优选地，水稻是日本晴(Nipponbare)品种；或者，优选地，所述水稻是皖粳97 (Wanjing 97)品种。在一个优选的方面，本发明提供一种将外源基因导入水稻细胞的方法，包括下述步骤(1)将水稻谷粒去壳、灭菌后将胚分离出来；(2)取步骤(1)所得的分离的胚置于愈伤组织诱导培养基上在约30°C暗培养约2 周以产生次生愈伤组织；(3)将步骤O)中获得的愈伤组织与携带外源基因和磷酸甘露糖异构酶(PMI)标记基因的农杆菌接触20分钟左右；(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到共培养基上，约23°C培养约48小时；(5)将步骤的愈伤组织置于恢复培养基上培养5天左右；(6)将步骤(5)的愈伤组织转移到含有蔗糖和甘露糖的选择培养基上，在约30°C 暗培养3周以获得出芽的愈伤组织；(7)将出芽的愈伤组织转移到再生培养基中继续培养；和(8)在再生培养基中培养约3周的愈伤组织转移至生根培养基中继续培养；其中所述步骤(1)中的谷粒是成熟谷粒，所述步骤O)中的诱导培养基是说明书表1所列出的NB培养基，所述步骤C3)中的与农杆菌接触是将所述愈伤组织浸泡在所述农杆菌的悬液中，所述步骤中的共培养基是说明书表1所列出的固体共培养基或液体共培养基，所述步骤(5)中的恢复培养基是说明书表1所列出的NBREC培养基，所述步骤(6) 中的选择培养基是说明书表1所列出的NBPMI培养基，其中含有约5g/L的蔗糖和约12. 5g/ L的甘露糖，并且不含抗生素或除草剂，所述步骤(7)中的再生培养基是选自包含如说明书表1所述成分的NBKN、NBKA、NBIZ或NBIK培养基中的任一种，所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的1/2MB培养基。在一个优选的实施方案中，其中所述农杆菌是根瘤农杆菌EHA105菌株。在一些优选的实施方案中，本发明所用的PMI标记基因的核苷酸序列选自(I)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)编码SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在特别优选的实施方案中，本发明所用的PMI标记基因序列如SEQ ID N0:1所示。 在本方面的优选实施方案中，所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是日本晴品种。或者更优选地，其中所述水稻是皖粳97品种。在另一个方面，本发明提供一种用于转化水稻的培养基套组，包括如下所述的组分(1)愈伤组织诱导培养基；(2)固体共培养培养基或液体滤纸共培养培养基；(3)恢复培养基；(4)选择培养基；(5)再生培养基；和任选地(6)生根培养基；其中所述(1)-(3)，(5)，(6)分别包含如本说明书表1所示的成分，所述(3)包含选自说明书表1所示的NBKN、NBKA, NBIZ或NBIK培养基中的任一种的成分。本方面还涉及这样的培养基套组用于将外源基因导入水稻细胞的程序的用途。所述的水稻优选粳稻，包括但不限于日本晴、皖粳97等品种。在一个方面中，本发明提供根据本发明的方法的任一实施方案获得的携带外源基因的水稻细胞。在一个方面中，本发明提供一种生产转基因水稻的方法，包括使用前述的任一方法将外源基因导入水稻细胞，并从获得的水稻细胞培育出水稻植株。通过本发明，可以实现对水稻尤其是粳稻的高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化；另一方面，通过本发明无需使用抗生素或除草剂选择，只需要进行一轮甘露糖选择就能够获得转化植株，与常规的使用抗生素或除草剂选择相比选择过程可以缩短近3周的时间，不但能够大大缩短选择过程的耗时，还降低了其环境压力，为开发工业规模的、环境友好的转基因水稻制备工艺提供了可能。
图1是本发明的示例性实施方案中农杆菌EHA105株的T-DNA区的示意图。35S 35S启动子。pat 草胺膦乙酰转移酶基因。Ubi 玉米遍在蛋白启动子。gfp 绿色荧光蛋白基因。Actl 水稻肌动蛋白1启动子。LB 左边界。RB 右边界。图2是在NB培养基上进行愈伤组织诱导的情况。A，在NB上培养7天后的皖粳97 种子(比例线，Imm) ；B，在NB上培养7日后的皖粳97胚(比例线，Imm) ；C:来自在NB上培养15日后的日本晴成熟胚的次级愈伤组织(比例线，2mm)。它们都适于侵染前的预培养。图3是经侵染的日本晴愈伤组织在恢复培养后的GFP测定情况。A，光照下的愈伤组织；B，荧光下的同一愈伤组织(比例线，2mm)。图4是用8种不同比例的蔗糖-甘露糖组合作为碳源选择日本晴和皖粳97的选择率。每个处理包括70-100个愈伤组织，且重复3次。图5是再生培养基的优化结果。每个处理包括70-100个愈伤组织，且重复3次。图6是甘露糖抗性日本晴愈伤组织在不同的再生培养基上培养3周后的结果。A， NBIZ ；B, NBKN ；C, NBKA ；D, NBIK。图7是再生的水稻幼苗的GFP测定情况。A，光照下的日本晴幼苗；B，荧光下的同一水稻幼苗。比例线，2cm。
图8是推定的转基因事件的PCR扩增结果。M，DNA标记DL 2000 ；P 质粒；N 未转化植物；1-15 独立转基因事件。图9是PMI试纸条测定的结果。N 未转化植物；1_5 独立转基因事件。图10是甘露糖抗性实验结果。A 在不含抗生素的NB甘露糖选择培养基上培养两周后的转基因日本晴系Tl种子；B 在不含抗生素的NB甘露糖选择培养基上培养两周后的非转基因日本晴系Tl种子图11显示移栽到温室的转基因水稻植株。A，温室中正常授粉的转基因植株；B，携带GOI的转基因日本晴植株显示了预期的表型，红色线指示非转基因植株黄色线指示独立的转基因事件。
具体实施例方式下面结合具体的实施方式来进一步说明本发明。应当理解这里描述的具体实施方式
只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式
中的实验方法和操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell,Molecular Cloning A Laboratory Manual,3rd ed. , Vols 1, 2 ；Charles Neal Stewart, Alisher Touraev, Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira, Plant Transformation Technologies 等。本文中所述的“约”或“左右”，除非另有特别说明或与上下文明显冲突，表示其所指的参数可以取在所述的具体数值的基础上在一定范围内，例如在所述具体数值的基础上士5%的值，只要能保证能够获得预期的结果即可。本领域技术人员在实施本发明的方法时，结合本说明书的教导，很容易在这里给出的具体实施方式
中所用的具体参数数值的基础上，对参数数值加以适当调整以适应具体的实验条件和材料，而不偏离本发明的范围。1.材料和方法1. 1.植物材料、外植体制备和生长条件选取水稻品种日本晴(Nipponbare)和皖粳97 (Wanjing97)(来自中国安徽省)的饱满、外观正常的谷粒(种子)，去壳、灭菌后，在30°C的双蒸水中黑暗浸泡过夜。用刮刀沿糊粉层分离盾片，朝上放置在NB培养基(成分如下所述)上30°C暗培养以诱导愈伤组织。 两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以用作经预培养的外植体来进行下面的侵染。生长条件为愈伤组织诱导、预培养、恢复和选择均在30°C左右的黑暗中进行；共培养在约23°C的黑暗中进行；再生和生根在约30°C光照下进行，光强度为约60001x，光周期为约16h日/8h夜。1. 2.试剂和培养基除非另有说明，本文所述具体实施方式
中使用的化学品购自Sigma(美国Saint Louis)。使用的各种培养基的组成如表1所示。除非另有说明，培养基的PH值为5.8。表 1本研究中使用的培养基的示例性配方
权利要求
1.一种将外源基因导入水稻皖粳97品种的细胞的方法，包括下述步骤(1)将成熟水稻谷粒去壳、灭菌后将胚分离出来；(2)取步骤(1)所得的分离的胚置于愈伤组织诱导培养基上在30°C暗培养2周以产生次生愈伤组织；(3)将步骤O)中获得的愈伤组织与携带外源基因和磷酸甘露糖异构酶(PMI)标记基因的农杆菌接触20分钟；(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到共培养基上，23°C培养48小时；(5)将步骤的愈伤组织置于恢复培养基上培养5天；(6)将步骤(5)的愈伤组织转移到含有蔗糖和甘露糖的选择培养基上，在30°C暗培养 3周以获得出芽的愈伤组织；和(7)将出芽的愈伤组织转移到再生培养基中继续培养。
2.权利要求1的方法，进一步包括步骤(8)在再生培养基中培养3周的愈伤组织转移至生根培养基中继续培养。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤3所述的与农杆菌接触是将所述愈伤组织浸泡在所述农杆菌的悬液中，所述农杆菌的悬液是在侵染当天将农杆菌以OD66tl约0. 05-0. 25悬浮包含如说明书表1所示成分的液体滤纸培养基中而制备的。
4.权利要求3的方法，其中所述农杆菌是根瘤农杆菌EHA105菌株。
5.权利要求1或2的方法，其中所述选择培养基中含有5g/L的蔗糖和12.5g/L的甘露糖。
6.权利要求5的方法，其中所述选择培养基中不含抗生素或除草剂。
7.权利要求1或2的方法，其中所述PMI标记基因的核苷酸序列选自(1)SEQID NO 1所示的核苷酸序列；或(2)编码SEQID NO :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.一种生产转基因水稻皖粳97品种的方法，包括1)通过1-7中任一权利要求的方法将外源基因导入水稻皖粳97品种的细胞；和2)从步骤1)获得的细胞培育水稻皖粳97品种的植株。
全文摘要
本发明提供一种利用PMI选择标记高效率地将外源基因导入水稻细胞的方法、所用的转化系统、以及利用该方法制备转基因水稻的方法。
文档编号A01H4/00GK102337293SQ20111030311
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者李 浩, 段永波, 章旺根, 翟晨光 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所