水稻转基因遗传转化方法
【专利摘要】本发明涉及一种水稻转基因遗传转化方法，其首先通过成熟胚诱导胚性愈伤组织并继代2～3次，挑选呈淡黄色且松散的颗粒状愈伤组织进行饥饿处理一定时间；然后，用含有一定浓度钙离子的侵染液侵染一定时间，并在侵染后吸干侵染液；接着转置共培养基中培养，再转置恢复培养基中恢复培养，最后再转置筛选培养基中培养，紧接着挑选呈淡黄色且松散的愈伤组织转置分化培养基中进行分化培养，培养一定天数后可长出不定芽，即为转基因植株。本发明的方法步骤简单，操作方便，相比传统的水稻遗传转化方法转化周期更短，转化效率更高，使得遗传转化更加方便、容易，可广泛应用于水稻遗传转化过程中，适于推广与应用。
【专利说明】水稻转基因遗传转化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻转基因育种技术研究领域，尤其涉及一种水稻转基因遗传转化方法。
【背景技术】
[0002]随着生物技术的不断发展，利用转基因技术进行转基因育种也受到了各国科学家的重视。改进的水稻遗传转化系统其操作简单、转化效率高的优点，在水稻遗传转化过程中将会受到广泛的应用。目前，传统的农杆菌介导的水稻转基因技术，通过成熟胚诱导愈伤组织，直接进行农杆菌侵染，诱导胚状体获得转基因植株，该方法耗时长，最重要的是转化效率极低。利用幼胚作为转化受体进行遗传转化，该法受时间限制，往往转化周期会更长，转化效率低，往往给科研工作带来很多不变。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有水稻转基因遗传转化方法操作繁琐、耗时长且转化效率低，给科研工作带来诸多不便的问题而提出一种操作简单、方便且转化周期短、效率高，能方便实际应用的水稻转基因遗传转化方法。
[0004]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0005]上述的水稻转基因遗传转化方法，其包括以下步骤:
[0006](1.0)愈伤组织诱导，即选取饱满的水稻种子剥去颖壳，用乙醇浸泡，随后用升汞溶液浸泡，再用无菌水漂洗，之后接种于诱导培养基上培养；愈伤组织经过2~3次继代后，挑选生长状况较好、组织松散、淡黄色颗粒状的愈伤组织继代备用；
[0007](2.0)饥饿处理，即挑选上述步骤(1.0)继代后生长状况较好、组织松散、淡黄色颗粒状的愈伤组织置于瓶中，在合适温度下饥饿处理，备用；
[0008](3.0)侵染
[0009](3.1)在无菌条件下，从固体细菌培养基上挑取一株农杆菌单菌落接于含有抗生素的液体细菌培养基中，在恒温摇床上振荡过夜培养；(3.2)将上述步骤(3.1)中过夜培养的菌液转至离心管中离心，收集菌体；(3.3)将上述步骤(3.2)离心后的菌液弃去离心管中的上清液，再向收集的菌体中加入适量新鲜的液体细菌培养基，接着从离心管中取出适量的菌液加入到液体细菌培养基中，直至农杆菌的浓度适当即可，再加入乙酞丁香酮，用于侵染农杆菌；(3.4)将上述步骤(2.0)中饥饿处理后的胚性愈伤组织置于一定浓度的钙离子侵染液中侵染一定时间后，再置于滤纸上吸干备用；
[0010](4.0)培养
[0011](4.1)共培养，即将上述步骤(3.4)获得的愈伤组织转置共培养培养基中，在合适温度条件暗培养；(4.2)恢复培养，即将上述步骤(4.1)中获得的愈伤组织用无菌水清洗，然后用无菌滤纸吸干，转置恢复培养基中，在合适温度条件下光照培养；(4.3)筛选培养，即将上述步骤(4.2)获得的愈伤组织转置筛选培养基中，在合适温度条件光照培养，并根据情况适时更换培养基；(4.4)分化培养，即将上述步骤(4.3)获得新鲜、疏散且呈淡黄色的愈伤组织放置于分化培养基中培养，在合适温度条件光照培养，并根据情况适时更换培养基；待分化出的不定芽长到一定长度时，将其小心移入生根培养基中诱导生根。
[0012]所述水稻转基因遗传转化方法，其中:所述步骤(1.0)中将剥去颖壳的种子用70%~75%乙醇浸泡4~5min，随后用0.1%~0.2%的升汞溶液浸泡10~20min，再用无菌水漂洗3~5次，之后接种于诱导培养基上培养；所述诱导培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、2.0mg/L的脱落酸、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的琼脂粉组成。
[0013]所述水稻转基因遗传转化方法，其中:所述步骤(2.0)中是将挑选好的愈伤组织置于100~200mL三角瓶中，在20~25°C的温度条件下饥饿处理2~5天，备用。
[0014]所述水稻转基因遗传转化方法，其中:所述步骤(3.1)中是将挑取的农杆菌单菌落接于50~IOOmL含有40~60mg/L抗生素的液体细菌培养基中，在25~28°C，150~200r/min的恒温摇床上振荡过夜培养；所述步骤(3.2)是将所述步骤(3.1)中过夜培养的菌液转至离心管中，在4~6°C下,4000~6000rpm/min,离心8~15min,收集菌体；所述步骤(3.3)中是将从离心管中取出适量的菌液加入到含有20~50mM CaCl2的液体细菌培养基中，直至农杆菌的浓度适当即可，再加入80~100μ LlO~20mg/mL的乙酞丁香酮,用于侵染农杆菌；所述步骤(3.4)中是将所述步骤(1.0)中继代好的胚性愈伤组织置于一定浓度的钙离子侵染液中侵染30~60min。
[0015]所述水稻转基因遗传转化方法，其中:所述步骤(4.1)中是将第三步获得的愈伤组织转置于共培养培养基中，在22~28°C的温度条件暗培养2~4天；所述共培养培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、
0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的鹿糖及7g/L的琼脂粉组成。
[0016]所述水稻转基因遗传转化方法，其中:所述步骤(4.2)中是将所述步骤(4.1)中获得的愈伤组织用无菌水清洗2~4次，用无菌滤纸吸干，转置恢复培养基中，在22~28°C的温度条件光照培养7~10天；所述恢复培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的鹿糖及7g/L的琼脂粉组成。
[0017]所述水稻转基因遗传转化方法，其中:所述步骤(4.3)中是将所述步骤(4.2)获得的愈伤组织转置筛选培养基中，在22~28°C的温度条件光照培养30~40天，每隔10~15天换一次培养基；所述筛选培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉以及一定浓度的筛选抗生素组成。
[0018]所述水稻转基因遗传转化方法，其中:所述步骤(4.4)中是将所述步骤(4.3)获得的愈伤组织放置于分化培养基中培养，在25~28°C，10~15h光照培养，15~20天更换一次培养基，连续培养4~6周；待分化出的不定芽长到Icm以上时，将其小心移入生根培养基中诱导生根；所述分化培养基由MS培养基、0.8mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的玉米素及2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤组成；所述生根培养基由MS培养基、0.8mg/L的萘乙酸、2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤组成。
[0019]有益效果:[0020]本发明水稻转基因遗传转化方法步骤简单，操作方便，相比传统的水稻遗传转化方法转化周期更短，转化效率更高，使得遗传转化更加方便、容易。其中，本发明通过对愈伤组织进行饥饿处理，增加细胞吸收外界养分的能力，同时增加细胞的穿透性；同时，在侵染液中加入一定量的外源钙，可以增加细胞膜的穿透性，利于外源基因片段进入细胞内，可广泛应用于水稻遗传转化过程中，适于推广与应用。
【具体实施方式】
[0021]本发明水稻转基因遗传转化方法，其包括以下步骤:
[0022]SO10、愈伤组织诱导
[0023]即选取饱满的水稻种子，用70%~75%乙醇浸泡4~5min，随后用0.1%~0.2%的升汞溶液浸泡10~20min，再用无菌水漂洗3~5次，之后接种于诱导培养基上培养；愈伤组织经过2~3次继代后，挑选生长状况较好、组织松散、淡黄色颗粒状的愈伤组织继代备用；其中，该诱导培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、2.0mg/L的脱落酸、
0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L蔗糖及7g/L的琼脂粉组成；
[0024]S020、饥饿处理
[0025]即挑选步骤SOlO继代后生长状况较好、组织松散、淡黄色颗粒状的愈伤组织置于100~200mL三角瓶中，在20~25°C的温度条件下饥饿处理2~5天，备用；
[0026]S030、侵染
[0027]S031、在无菌条件下，从固体细菌培养基上挑取一株农杆菌单菌落接于50~IOOmL含有40~60mg/L抗生素的液体细菌培养基中，在25~28°C，150~200r/min的恒温摇床上振荡过夜培养；
[0028]S032、将步骤S031中过夜培养的菌液转至离心管中，在4~6°C下，4000~6000rpm/min,离心8~15min，收集菌体；
[0029]S033、弃去离心管中的上清液，再向收集菌体的中加入适量新鲜的液体细菌培养基，从离心管中取出适量的菌液加入到含有20~50mM CaCl2的液体细菌培养基中，直至农杆菌的浓度适当即可，再加入80~100 μ LlO~20mg/mL的乙酞丁香酮(AS)，用于侵染农杆菌；
[0030]S034、将上述步骤SOlO中继代好的胚性愈伤组织置于一定浓度的钙离子侵染液中侵染30~60min之后，置于滤纸上吸干备用；
[0031]S040、培养
[0032]S041、共培养，即将上述步骤S034获得的愈伤组织转置共培养培养基中，在22~280C的温度条件暗培养2~4天；其中，该共培养培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的鹿糖及7g/L的琼脂粉组成；
[0033]S042、恢复培养，即将上述步骤S041中获得的愈伤组织用无菌水清洗2~4次，用无菌滤纸吸干，转置中，在22~28°C的温度条件光照培养7~10天；其中，该恢复培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、
0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的鹿糖及7g/L的琼脂粉组成；
[0034]S043、筛选培养，即将上述步骤S042获得的愈伤组织转置筛选培养基中，在22~28°C的温度条件光照培养30~40天，每隔10~15天换一次培养基；其中，该筛选培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、
0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉以及一定浓度的筛选抗生素组成；
[0035]S044、分化培养，即将上述步骤S043获得新鲜、疏散，呈淡黄色的愈伤组织放置于分化培养基中培养，在25~28°C，10~15h光照培养，15~20天更换一次培养基，连续培养4~6周；待分化出 的不定芽长到Icm以上时，将其小心移入生根培养基中诱导生根；其中，该分化培养基由MS培养基、0.8mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的玉米素及2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤组成；该生根培养基由MS培养基、0.8mg/L的萘乙酸、2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤组成。
[0036]本发明操作步骤简单、方便，相比传统的水稻遗传转化方法耗时更短，转化效率更高，使得遗传转化变得相对简单、容易，可广泛应用于水稻遗传转化过程中。
[0037]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作任何其他形式的限制，而依据本发明的技术实质所作的任何修改或等同变化，仍属于发明所要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种水稻转基因遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤: (1.0)愈伤组织诱导 即选取饱满的水稻种子剥去颖壳，用乙醇浸泡，随后用升汞溶液浸泡，再用无菌水漂洗，之后接种于诱导培养基上培养；愈伤组织经过2~3次继代后，挑选生长状况较好、组织松散、淡黄色颗粒状的愈伤组织继代备用； (2.0)饥饿处理 即挑选上述步骤(1.0)继代后生长状况较好、组织松散、淡黄色颗粒状的愈伤组织置于瓶中，在合适温度下饥饿处理，备用； (3.0)侵染 (3.1)在无菌条件下，从固体细菌培养基上挑取一株农杆菌单菌落接于含有抗生素的液体细菌培养基中，在恒温摇床上振荡过夜培养； (3.2)将上述步骤(3.1)中过夜培养的菌液转至离心管中离心，收集菌体； (3.3)将上述步骤(3.2)离心后的菌液弃去离心管中的上清液，再向收集的菌体中加入适量新鲜的液体细菌培养基，接着从离心管中取出适量的菌液加入到液体细菌培养基中，直至农杆菌的浓度适当即可，再加入乙酞丁香酮，用于侵染农杆菌； (3.4)将上述步骤(2.0)中饥饿处理后的胚性愈伤组织置于一定浓度的钙离子侵染液中侵染一定时间后，再置于滤纸上吸干备用； (4.0)培养 (4.1)共培养，即将上述步骤(3.4)获得的愈伤组织转置共培养培养基中，在合适温度条件暗培养； (4.2)恢复培养，即将上述步骤(4.1)中获得的愈伤组织用无菌水清洗，然后用无菌滤纸吸干，转置恢复培养基中，在合适温度条件下光照培养； (4.3)筛选培养，即将上述步骤(4.2)获得的愈伤组织转置筛选培养基中，在合适温度条件光照培养，并根据情况适时更换培养基； (4.4)分化培养，即将上述步骤(4.3)获得新鲜、疏散且呈淡黄色的愈伤组织放置于分化培养基中培养，在合适温度条件光照培养，并根据情况适时更换培养基；待分化出的不定芽长到一定长度时，将其小心移入生根培养基中诱导生根。
2.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(1.0)中将剥去颖壳的种子用70%~75%乙醇浸泡4~5min，随后用0.1%~0.2%的升汞溶液浸泡10~20min，再用无菌水漂洗3~5次，之后接种于诱导培养基上培养； 所述诱导培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、2.0mg/L的脱落酸、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的琼脂粉组成。
3.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(2.0)中是将挑选好的愈伤组织置于100~200mL三角瓶中，在20~25°C的温度条件下饥饿处理2~5天，备用。
4.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(3.1)中是将挑取的农杆菌单菌落接于50~IOOmL含有40~60mg/L抗生素的液体细菌培养基中，在25~28°C，150~200r/min的恒温摇床上振荡过夜培养； 所述步骤(3.2)是将所述步骤(3.1)中过夜培养的菌液转至离心管中，在4~6°C下，4000~6000rpm/min,离心8~15min,收集菌体； 所述步骤(3.3)中是将从离心管中取出适量的菌液加入到含有20~50mM CaCl2的液体细菌培养基中，直至农杆菌的浓度适当即可，再加入80~100 μ LlO~20mg/mL的乙酞丁香酮，用于侵染农杆菌； 所述步骤(3.4)中是将所述步骤(1.0)中继代好的胚性愈伤组织置于一定浓度的钙离子侵染液中侵染30~60min。
5.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(4.1)中是将第三步获得的愈伤组织转置于共培养培养基中，在22~28°C的温度条件暗培养2~4天； 所述共培养培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的琼脂粉组成。
6.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(4.2)中是将所述步骤(4.1)中获得的愈伤组织用无菌水清洗2~4次，用无菌滤纸吸干，转置恢复培养基中，在22~28°C的温度条件光照培养7~10天； 所述恢复培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、 0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的琼脂粉组成。
7.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(4.3)中是将所述步骤(4.2)获得的愈伤组织转置筛选培养基中，在22~28°C的温度条件光照培养30~40天，每隔10~15天换一次培养基； 所述筛选培养基由N6培养基、2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉以及一定浓度的筛选抗生素组成。
8.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于:所述步骤(4.4)中是将所述步骤(4.3)获得的愈伤组织放置于分化培养基中培养，在25~28°C，10~15h光照培养，15~20天更换一次培养基，连续培养4~6周；待分化出的不定芽长到Icm以上时，将其小心移入生根培养基中诱导生根； 所述分化培养基由MS培养基、0.8mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的玉米素及2.0mg/L的6-节氨基嘌呤组成； 所述生根培养基由MS培养基、0.8mg/L的萘乙酸、2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤组成。
【文档编号】C12N15/84GK103740752SQ201310731487
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】朱永兴, 许兴, 李树华, 白海波, 吕学莲, 董建力, 关雅静, 张岩, 麻冬梅 申请人:宁夏农林科学院