水稻条纹病毒p3基因用于制备转基因抗稻瘟病植物体的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)p3基因用于制备转基因抗稻瘟病植物体的应用。该基因的核苷酸序列为SEQ?IDNO：1所示。该基因来源于水稻条纹病毒，通过GenBank序列比对设计引物从我们田间采集的水稻病株上序列扩增而来。作为优选，该基因用于制备抗稻瘟病水稻。本发明具体优势如下：(1)目前的抗稻瘟病基因多数是水稻内源基因，p3作为病毒蛋白能够提高水稻对稻瘟病的抗性，丰富了抗稻瘟病基因资源。(2)正因为p3基因不是水稻内源抗性基因，所以它的抗性机制可能与其他抗性基因不同，有助于人们对水稻抗稻瘟菌机理和稻瘟菌致病机理的理解。
【专利说明】水稻条纹病毒P3基因用于制备转基因抗稻瘟病植物体的应用【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】及植物病害防治领域，尤其涉及水稻条纹病毒{Rice stripe virus, RSV)P3基因在植物抗稻痕病中的应用领域。
【背景技术】
[0002]水稻条纹病毒(TPice Stripe virus, RSV)是由灰飞虱传播的一种重要水稻病毒，由该病毒导致的水稻条纹叶枯病在我国持续发生，造成严重经济损失。近年来，我国科学家针对RSV的生物学和分子生物学研究开展了一系列细致而深入的工作:测定了病毒全基因组序列、鉴定了病毒沉默抑制蛋白、运动蛋白、开展了水稻互作蛋白的分离筛选工作、建立了灰飞虱饲毒、检测技术、综合防治技术等工作，这些工作所取得的进展加深了人们对于RSV致病机制的了解。RSV的p3基因编码一个沉默抑制蛋白，通过与siRNA结合起到抑制RNA沉默的作用。
[0003]稻瘟病又名稻热病，俗称火烧瘟、吊头瘟、掐颈瘟等，是世界性的重要稻病，在我国它同纹枯病、白叶枯病被列为水稻三大病害，由稻梨孢菌(PyriculeirieioryzeieQiv.)引起，在世界各水稻产区都有发生，其中以亚洲和非洲稻区发病最为严重。稻瘟病是危害我国水稻产区的三大水稻病害之一，一般可造成产量损失10%-30%，流行时产量损失可达40%-50%。
[0004]防治稻瘟病的最经济有效的措施是选育和种植抗病品种。传统的防治方法是通过不断更换农药品种以及加大农药使用量来防治稻瘟病，这对生态环境和人类健康产生压力。利用植物基因工程可向现有栽培品种中导入外源基因而不受种属限制，拓展可利用基因的来源，为作物抗病育种工作开辟了一条崭新而有效的途径。
【发明内容】
[0005]为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供水稻条纹病毒{Ricestripe virus, RSV)p3基因用于制备转基因抗稻痕病植物体的应用。本发明的第一个目的是提供一种抗稻瘟病的水稻的制备方法。
[0006]为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案:
水稻条纹病毒stripe virus, RSV)p3基因用于制备转基因抗稻痕病植物体的应用。该基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:1所示。该基因来源于水稻条纹病毒，通过GenBank序列比对设计引物从我们田间采集的水稻病株上序列扩增而来。作为优选，该基因用于制备抗稻瘟病水稻。
[0007]为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种抗稻瘟病的水稻的制备方法，该方法采用包含水稻条纹病毒{Rice stripevirus, RSV)p3基因的宿主细胞对水稻成熟胚进行的遗传转化获得。作为优选，所述的宿主细胞由包含水稻条纹病毒stripe virus, RSV)p3基因的植物表达载体转化。作为再优选，转化菌株为农杆菌菌株EHA105。
[0008]作为优选，所述的宿主细胞的制备方法包括以下的步骤:
(1)水稻条纹病毒P3基因的克隆及载体构建
通过GenBank中的RSV p3序列分析,设计如下引物用于从田间采集的RSV侵染水稻病株中扩增得到水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，引物设计时已加入酶切位点，用于将p3基因重组到双元表达载体PCV1300中；引物序列如下:
P3 (+): 5’ - T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5’ - G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3’ ； (2)转化农杆菌
取-70 °C保存的EHA105农杆菌感受态，置冰上融解；取I μ I抽纯pCV_P3_C质粒加入到100 μ I感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯；设置2200V电压，电击转化；点击完成加入900 μ I的液体YEP培养基，28 V，200 rpm摇床培养1.5 h，菌液涂布在含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上，28 °C培养至形成单菌落。
[0009]作为优选，所述的抗稻瘟病的水稻的制备方法包括以下的步骤:
1)菌液的准备
取-70 °C保存的包含水稻条纹病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的阳性转化菌株，于含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上划线，28 °C培养至形成单菌落，挑取单菌落于含50 μ g/ml KanUOO ug/ml Rif的YEP液体培养基中培养，28°C，220rpm振荡培养24 h ;将菌液按1:100用YEP培养基稀释，继续震荡培养至0D600为0.6 ;
2)水稻成熟胚愈伤组织的诱导与培养
取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子；将种子放入100 ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒lmin，无菌水洗3_5遍，直到没有酒精味道；加入50 ml 20%次氯酸钠；溶液，浸泡30min ;倒去次氯酸钠溶液,用无菌蒸懼水清洗种子4_5遍,最后一遍浸泡30min ;种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿9-12颗；操作完毕用封口膜；封好培养皿，在28°C光照培养箱，培养3周；在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织，置入继代培养基中，在28°C光照培养箱，继代培养I周；
3)愈伤组织与农杆菌的共培养
收集菌体，用含200 Mmol/L As的AAM感菌液制成悬浮液，使菌液0D600的终浓度为0.1 ;将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5min ;将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上浙干30-40min ;将愈伤组织置于共培养基上；26°C暗培养2.5d ；
4)抗性愈伤的筛选与分化
将愈伤组织取出，用无菌水清洗I遍，再用含500 mg/L头孢拉定或头孢噻肟钠的无菌水浸泡30 min,清洗3-5遍，置于无菌滤纸上浙干2h。随后将晾干的愈伤转入选择培养基上进行第一轮选择，28°C，光照培养14d ;将长有抗性愈伤的初始愈伤进行第二轮选择，28°C，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；挑取颜色鲜黄的颗粒类抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中，放入恒温培养室中，等待分化成苗；
5)生根壮苗和移载
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2 cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周；选择高10 Cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。
[0010]本发明通过设计引物克隆基因阅读框全长，构建表达载体，通过遗传转化与分子技术检测，获取稳定遗传的转p3基因植株。然后对转基因植株接种稻瘟菌，进行抗稻瘟分析，筛选抗病株系。本发明获取的转P3基因水稻，主要应用于抗稻瘟菌水稻育种，避免真菌病害的为害。本发明对培育高抗稻瘟病水稻具有重要的理论及实际意义，对植物病害防治其他领域也有指导作用。与通过其他抗稻瘟菌策略获得的抗性株系相比，本发明具体优势如下:
(I)目前的抗稻瘟病基因多数是水稻内源基因，P3作为病毒蛋白能够提高水稻对稻瘟病的抗性，丰富了抗稻瘟病基因资源。
[0011](2)正因为p3基因不是水稻内源抗性基因，所以它的抗性机制可能与其他抗性基因不同，有助于人们对水稻抗稻瘟菌机理和稻瘟菌致病机理的理解。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1:含有p3基因的载体的构建图谱。
[0013]图2:转p3基因水稻的DNA PCR检测图谱。
[0014]图3:转p3基因水稻的Northern blot检测图谱。
[0015]图4:转p3基因水稻的抗稻瘟病鉴定显示接种后的叶片。
[0016]图5:转p3基因水稻的抗稻瘟病鉴定显示接种后叶片的坏死斑数量差异。
[0017]图6:转p3基因水稻的抗稻瘟 病鉴定显示接种后叶片的坏死斑大小差异。 【具体实施方式】
[0018]本发明所转水稻品种为日本晴。
[0019]1.重组农杆菌的获得 (I) P3克隆及载体构建
本发明通过GenBank中的RSV p3序列分析,设计如下引物用于从田间采集的RSV侵染水稻病株中扩增得到P3基因序列，引物设计时已加入酶切位点，用于将p3基因重组到双元表达载体PCV1300中。引物序列如下:
P3 (+): 5’ - T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5，- G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3，。
[0020](2)转化农杆菌
取-70 °C保存的EHA105农杆菌感受态，置冰上融解。取I μ I抽纯pCV_P3_C质粒加入到100 μ I感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯。设置2200V电压，电击转化。点击完成加入900 μ I的液体培养基(YEP)。28 °C, 200 rpm摇床培养1.5 h，菌液涂布在含50μ g/ml卡那霉素(Kan)和100 μ g/ml利福平(Rif)平板上,28 °C培养至形成单菌落。
[0021](3)阳性克隆的鉴定与保存
挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50 μ g/ml KanUOO μ g/ml Rif的液体培养基中，28 °C, 200 rpm摇培16 h，取I μ I菌液进行PCR检测。检测引物为Ρ3 (+)、Ρ3㈠。取检测结果为阳性的菌液，混合15-30%甘油，置甘油管中，于_70°C超低温冰箱中保存，备用。
[0022]PCR体系如下:
【权利要求】
1.水稻条纹病毒{Ricestripe virus, RSV)p3基因用于制备转基因抗稻痕病植物体的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:该基因用于制备抗稻瘟病水稻。
3.一种抗稻瘟病的水稻的制备方法，其特征在于:该方法采用包含水稻条纹病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的宿主细胞对水稻成熟胚进行的遗传转化获得。
4.根据权利要求3所述的一种抗稻瘟病的水稻的制备方法，其特征在于:所述的宿主细胞由包含水稻条纹病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的植物表达载体转化。
5.根据权利要求4所述的一种抗稻瘟病的水稻的制备方法，其特征在于:转化菌株为农杆菌菌株EHA105。
6.根据权利要求4所述的一种抗稻瘟病的水稻的制备方法，其特征在于:所用载体为PCV1300。
7.根据权利要求5所述的一种抗稻瘟病的水稻的制备方法，其特征在于宿主细胞的制备方法包括以下的步骤: (1)水稻条纹病毒P3基因的克隆及载体构建 通过GenBank中的RSV p3序列分析,设计如下引物用于从田间采集的RSV侵染水稻病株中扩增得到水稻条纹病毒(/Pice stripe virus, RSV)p3基因，引物设计时已加入酶切位点，用于将P3基因重组到双元表达载体PCV1300中；引物序列如下:
P3 (+): 5’ - T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’
P3 (-): 5’ - G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3’ ； (2)转化农杆菌 取-70 °C保存的EHA105农杆菌感受态，置冰上融解；取I μ I抽纯pCV_P3_C质粒加入到100 μ I感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯；设置2200V电压，电击转化；点击完成加入900 μ I的液体YEP培养基，28 0C, 200 rpm摇床培养1.5 h，菌液涂布在含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上，28 °C培养至形成单菌落。
8.根据权利要求3或5或7所述的一种抗稻瘟病的水稻的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤: 1)菌液的准备 取-70 °C保存的包含水稻条纹病毒{Rice stripe virus, RSV)p3基因的阳性转化菌株，于含50 μ g/ml卡那霉素和100 μ g/ml利福平平板上划线，28 °C培养至形成单菌落，挑取单菌落于含50 μ g/ml KanUOO ug/ml Rif的YEP液体培养基中培养，28°C，220rpm振荡培养24 h ;将菌液按1:100用YEP培养基稀释，继续震荡培养至OD_为0.6 ; 2)水稻成熟胚愈伤组织的诱导与培养 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子；将种子放入100 ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒lmin，无菌水洗3_5遍，直到没有酒精味道；加入50 ml 20%次氯酸钠；溶液，浸泡30min ;倒去次氯酸钠溶液,用无菌蒸懼水清洗种子4_5遍,最后一遍浸泡30min ;种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿9-12颗；操作完毕用封口膜；封好培养皿，在28°C光照培养箱，培养3周；在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织，置入继代培养基中，在28°C光照培养箱，继代培养I周； 3)愈伤组织与农杆菌的共培养收集菌体，用含200 Mmol/L As的AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD6c?的终浓度为0.1 ；将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5min ;将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上浙干30-40min ;将愈伤组织置于共培养基上；26°C暗培养2.5d ； 4)抗性愈伤的筛选与分化 将愈伤组织取出，用无菌水清洗I遍，再用含500 mg/L头孢拉定或头孢噻肟钠的无菌水浸泡30 min，清洗3-5遍，置于无菌滤纸上浙干2h ； 随后将晾干的愈伤转入选择培养基上进行第一轮选择，28°C,光照培养14d ;将长有抗性愈伤的初始愈伤进行第二轮选择，28°C，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；挑取颜色鲜黄的颗粒类抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中，放入恒温培养室中，等待分化成苗； 5)生根壮苗和移载 当抗性愈伤组织分化的芽长至约 2 cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周；选择高10 cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。
【文档编号】A01H5/00GK103497971SQ201310469665
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】燕飞, 吴根土, 王教瑜, 王艳丽, 孙国昌, 陈剑平 申请人:浙江省农业科学院